哮喘患兒外周血單個核細(xì)胞瘦素與RORγt和Foxp3表達(dá)的關(guān)系

柳菊芬 沃小敏 潘陽 李明安

【摘要】 目的：探討哮喘患兒外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分泌的瘦素水平變化及其與Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt （RORγt）和Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）表達(dá)的關(guān)系。方法：選取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患兒設(shè)為哮喘組。根據(jù)哮喘組患兒疾病所處的時期不同，分為發(fā)作期和緩解期。對哮喘發(fā)作期兒童經(jīng)規(guī)則聯(lián)合吸入糖皮質(zhì)激素/長效β2受體激動劑（ICS/LABA）治療后定期隨訪，無癥狀和體征超過3個月以上作為緩解期。選取同期在本院體檢25例的健康兒童為對照組。比較哮喘組發(fā)作期和緩解期及對照組的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達(dá)水平，并分析哮喘組發(fā)作期患兒瘦素與PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的相關(guān)性。結(jié)果：對照組、哮喘組發(fā)作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。哮喘組發(fā)作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達(dá)量均高于對照組和哮喘組緩解期，F(xiàn)EV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發(fā)作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。哮喘組患兒發(fā)作期PBMC培養(yǎng)上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關(guān)（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.854，P<0.01）。結(jié)論：哮喘患兒PBMC分泌的瘦素與RORγt mRNA呈正相關(guān)，與Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 瘦素 哮喘 外周血單個核細(xì)胞 維甲酸相關(guān)孤兒核受體γt 叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3

[Abstract] Objective： To investigate the levels of leptin derived by the peripheral blood mononuclear cells （PBMC） and the effect on RORγt （the transcription factor of Thl7 cells） and Foxp3 （the transcription factor of Foxp3+Treg cells） in children with asthma. Method： A total of 25 children with asthma admitted to our hospital from June 2018 to June 2020 were selected as the asthma group. According to the different period of the asthma group， the children were divided into attack stage and remission stage. Children in attack stage of asthma would be followed up regularly after regular treatment with inhalationcorticosteroid/long-acting β2 receptor agonists （ICS/LABA）， with no symptoms or signs for more than 3 months as the remission period. A total of 25 healthy children who underwent physical examination in the same period were selected as the control group. The levels of leptin， FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group were compared during attack and remission period. The correlation between leptin and FEV1， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in PBMC and between RORγt mRNA and Foxp3 mRNA of asthmatic group were analyzed. Result： There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA in the attack and remission stages of the asthma group and the control group （P<0.01）. The levels of leptin and RORγt mRNA in the attack stage of asthma group were higher than those of control group and asthma group at remission stage， and the levels of FEV1% and Foxp3 mRNA were lower than those of control group and asthma group at remission stage， the differences were statistically significant （P<0.01）. There were no significant differences in the levels of leptin， FEV1%， RORγt mRNA and Foxp3 mRNA between control group and the asthma group at remission stage （P>0.01）. There was positive correlation in the attack stages of the asthma group between the concentration of leptin in the supernatant of PBMC culture and the RORγt mRNA in PBMC （r=0.884， P<0.01）; and PBMC Foxp3 mRNA was negatively correlated （r=-0.926， P<0.01）; FEV1% was negatively correlated （r=-0.936， P<0.01）; Foxp3 mRNA was negatively correlated with RORγt mRNA （r=-0.854， P<0.01）. Conclusion： The leptin secreted by PBMC in asthmatic children was positively correlated with RORγt mRNA and negatively correlated with Foxp3 mRNA.

[Key words] Leptin Asthma Peripheral blood mononuclear cells RORγt Foxp3

First-author’s address： Shuyang People’s Hospital， Shuyang 223600， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.17.016

支氣管哮喘是由多因素共同作用、多種細(xì)胞及其細(xì)胞因子共同參與的呼吸道慢性炎癥性疾病。肥胖是支氣管哮喘的危險因素之一，且呈劑量依賴性[1-4]。瘦素為脂肪組織分泌的一種激素，其結(jié)構(gòu)與IL-6、IL-12、G-CSF等細(xì)胞因子相似，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，尤其在機(jī)體能量調(diào)節(jié)中起著重要的作用，在哮喘發(fā)病過程中也起著重要作用[5]。Th17是胸腺來源的CD4+ T細(xì)胞，Th17細(xì)胞以分泌白介素17（IL-17）為特征，其上游調(diào)控基因?yàn)榫S甲酸相關(guān)孤兒核受體γt （RORγt），Treg具有免疫調(diào)節(jié)和維持機(jī)體免疫耐受的作用，目前認(rèn)為其上游調(diào)控基因主要為叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）[6-7]。Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，兩者失衡與多種自身免疫性疾病有關(guān)，研究表明，哮喘的發(fā)病與Th1/Th2失衡有關(guān)[8-9]。但大量的研究表明哮喘的發(fā)病機(jī)制并不能簡單地用Th1/Th2失衡機(jī)制來解釋，在哮喘的發(fā)病過程中，Th17與Treg及其分泌的細(xì)胞因子也參與其中，因此Th17/Treg失衡也可能是哮喘發(fā)病機(jī)制之一，哮喘發(fā)病過程中不僅有Th1/Th2的失衡，也可能同時存Th17/Treg的失衡。

本研究分離哮喘患兒外周血單個核細(xì)胞并培養(yǎng)，檢測其上清液瘦素的濃度值，采用PCR法分別檢測Th17與Foxp3+ Treg上游特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量，并分析瘦素與RORγt、Foxp3 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，以探討瘦素在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月-2020年6月本院收治的25例哮喘患兒設(shè)為哮喘組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）哮喘的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》（2008版）[10];（2）經(jīng)治療后緩解期隨訪數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并肺結(jié)核、支氣管肺炎等呼吸道疾病;（2）合并腎小球腎炎、風(fēng)濕性疾病等免疫性疾病;（3）合并惡性腫瘤;（4）就診前1個月應(yīng)用過免疫抑制劑。選取同期在本院體檢的25例健康兒童為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：體檢顯示健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：依從性差、不配合。根據(jù)哮喘組患兒疾病所處的時期不同，分為發(fā)作期和緩解期。對哮喘發(fā)作期兒童經(jīng)規(guī)則聯(lián)合吸入糖皮質(zhì)激素/長效β2受體激動劑（ICS/LABA）治療后定期隨訪，無癥狀和體征超過3個月以上作為緩解期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組兒童監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMI的測定 測量所有入選兒童的身高和體重，并計(jì)算其體質(zhì)指數(shù)（BMI），BMI=體重（kg）/身高2（m2）。

1.2.2 外周血的采集及單個核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 哮喘組患兒發(fā)作期于治療前采集外周血，哮喘組緩解期于緩解期采集外周血，對照組于體檢時采集外周血。均空腹采集靜脈血5 mL，三組標(biāo)本均用肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液分離得人外周血單個核細(xì)胞，同時分離血漿于（-80 ℃）保存待測。將分離的外周血單個核細(xì)胞用1640培養(yǎng)液（培養(yǎng)液內(nèi)含有10%胎牛血清）重懸后接種于24孔板（每孔0.5 mL），終濃度為2×106/mL。加入anti-CD28（2 mg/L）、anti-CD3（10 mg/L）抗，鏈霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL），放置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)上清液于（-80 ℃）保存待測，并收集細(xì)胞。

1.3 觀察指標(biāo) 比較哮喘組發(fā)作期和緩解期及對照組的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表達(dá)水平，并分析哮喘組患兒發(fā)作期瘦素濃度與PBMC的FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及RORγt mRNA與Foxp3 mRNA的相關(guān)性。（1）PBMC中RORγt mRNA及Foxp3 mRNA的測定。采用Invitrogen公司的TRIzol Reagen試劑提取單個核細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（東洋紡試劑盒），合成的cDNA于（-80 ℃）中保存?zhèn)溆?，以提取的cDNA為模板。用CFX 96熒光PCR儀，按照Bio-Rad Sybr Green Super Mix說明書要求，以GAPDH為內(nèi)參測定RORγt及Foxp3的相對表達(dá)量，每個標(biāo)本擴(kuò)增三次，然后算其均值。擴(kuò)增所用引物序列，RORγt上游引物為：5’-CCTGGGCTCCTCGCCTGACC-3’，下游引物為：5’-TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC-3’;Foxp3上游引物為：5’-GAAGCAGCGGACACTCAATG-3’，下游引物為：5’-AGGTGGCAGGATGGTTTCTG-3’;GAPDH上游引物為：5’-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物為：5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RORγt、Foxp3及GAPDH的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參校準(zhǔn)Foxp3的相對表示達(dá)量，結(jié)果分別用RORγt/GAPDH mRNA及Foxp3/GAPDH mRNA相對值來表示。（2）瘦素的檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清液的瘦素濃度（試劑盒由R&D system公司提供），具體操作過程按試劑說明書的要求進(jìn)行，用酶標(biāo)儀（生產(chǎn)廠家：Bio-Tek Instruments，型號：uQuant）讀取吸光度值，用試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算相應(yīng)吸光值的瘦素濃度。（3）FEV1的檢測。兒童FEV1與年齡相關(guān)，本研究采用（實(shí)際值/預(yù)計(jì)值）×100%（FEV1%）表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，三組數(shù)據(jù)比較用方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 哮喘組男14例，女11例，平均年齡（8.20±2.16）歲，平均BMI（17.11±3.52）kg/m2。對照組男14例，女11例;平均年齡（8.32±2.32）歲，平均BMI（17.21±3.45）kg/m2。兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清液所測瘦素的濃度及外周血單個核細(xì)胞中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量的比較 對照組、哮喘組發(fā)作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。哮喘組發(fā)作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達(dá)量均高于對照組和哮喘組緩解期，F(xiàn)EV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發(fā)作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。見表1。

2.3 哮喘組患兒發(fā)作期瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA、Foxp3 mRNA及FEV1%的相關(guān)性分析 采用直線回歸相關(guān)性分析顯示，哮喘組患兒發(fā)作期PBMC培養(yǎng)上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關(guān)（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.854，P<0.01）。見圖1～4。

3 討論

哮喘是氣道慢性炎癥伴隨高通反應(yīng)的可逆性氣道阻塞性疾病，通常認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡是其發(fā)病的主要機(jī)制。哮喘患者Th1型免疫反應(yīng)減弱，Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)，Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5等細(xì)胞因子能增加IgE，并能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，是哮喘氣道炎癥的主要因素[11]。有研究顯示，并非所有哮喘都向Th2分化偏移，不能簡單地用Th1/Th2失衡來解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制，Th1細(xì)胞增加反而可能加重哮喘癥狀[9]。胡斯明等[12]研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠Treg/Th17顯著低于對照組，且與細(xì)胞因子相關(guān)，提示了哮喘的發(fā)病機(jī)制也可能和Treg/Th17的失衡機(jī)制相關(guān)。施宇衡等[13]研究表明，具有特征性轉(zhuǎn)錄因子的Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在哮喘發(fā)病中起重要作用，這些都證明了Treg、Th17參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，對照組、哮喘組發(fā)作期和緩解期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。哮喘組發(fā)作期的瘦素、RORγt mRNA相對表達(dá)量均高于對照組和哮喘組緩解期，F(xiàn)EV1%、Foxp3 mRNA均低于對照組和哮喘組緩解期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對照組和哮喘組發(fā)作期的瘦素、FEV1%、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.01）。而RORγt與Foxp3分別為Th17和Foxp3+ Treg的上游調(diào)控基因，因此RORγt mRNA和Foxp3 mRNA表達(dá)失衡可能是導(dǎo)致哮喘患兒Th17/Treg失衡的主要機(jī)制。

哮喘的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，瘦素通過何種途徑參與其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[14]。但有研究表明肥胖哮喘患者，癥狀較重且療效差，血清高瘦素濃度可增加小兒哮喘的發(fā)病風(fēng)險[15-16]。本研究顯示，哮喘組患兒發(fā)作期PBMC培養(yǎng)上清液瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關(guān)（r=0.884，P<0.01）;與PBMC的Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P<0.01）;與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.936，P<0.01）;Foxp3 mRNA與RORγt mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.854，P<0.01）。表明哮喘患兒急性期外周血單個核細(xì)胞分泌的瘦素增加，且與肺功能損傷密切相關(guān)?？梢奝BMC分泌的瘦素在哮喘發(fā)病機(jī)制中起重要作用。瘦素可通過抑制Treg的功能而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[17]。有研究對有瘦素基因或瘦素受體基因缺陷的小鼠進(jìn)行瘦素阻斷，發(fā)現(xiàn)能夠延緩小鼠自身免疫性腦脊髓的發(fā)展[18]。有研究表明，人外周血單個核細(xì)胞培養(yǎng)，瘦素能增加Th17的數(shù)量并呈劑量依賴性[19]。因此可以推測在哮喘發(fā)病機(jī)制中瘦素也能參與Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，哮喘患兒急性期PBMC培養(yǎng)上清液中的瘦素濃度與PBMC的RORγt mRNA呈正相關(guān)與PBMC的Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)，瘦素的結(jié)構(gòu)與白介素-6相似，白介素-6能調(diào)節(jié)Treg/Th17的平衡，因此哮喘患兒PBMC來源的瘦素也可能對Treg/Th17的平衡起重要的調(diào)節(jié)作用[20]。有研究在培養(yǎng)液加瘦素抗體，結(jié)果PBMC的Foxp3的表達(dá)量顯著增高，表明瘦素可通過對RORγt與Foxp3表達(dá)的調(diào)節(jié)參與對Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)[21]。

Th17和Treg在分化和功能上相互抑制，其分化成熟主要受其上游轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3的調(diào)控[6，22]。而本研究結(jié)果顯示，PBMC分泌的瘦素參與了哮喘患兒RORγt mRNA和Foxp3 mRNA平衡的調(diào)節(jié)，提示其對Th17/Treg平衡也起重要調(diào)節(jié)作用，可能的機(jī)制是瘦素通過介導(dǎo)RORγt的表達(dá)從而增加Th17致病作用;通過抑制Foxp3的表達(dá)，進(jìn)而抑制了Treg的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，哮喘患兒PBMC分泌的瘦素與RORγt mRNA呈正相關(guān)，與Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)。

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（收稿日期：2021-04-02） （本文編輯：張明瀾）