CAP2在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達及臨床價值

鐘愛芳 肖慧

【摘要】 目的：探討腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2（CAP2）在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達及臨床價值。方法：回顧性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例結(jié)腸癌患者的臨床資料。取患者結(jié)腸癌組織及癌旁組織，采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法測定組織CAP2 mRNA表達，采用免疫組化法測定組織CAP2蛋白表達，并測定術(shù)前血清癌胚抗原（CEA）、CA19-9水平。分析CAP2蛋白表達與臨床病理特征相關(guān)性;采用Kendall相關(guān)分析CAP2蛋白與CEA、CA19-9的相關(guān)性;采用受試者工作特征（ROC）曲線評估CAP2對結(jié)腸癌的診斷價值。結(jié)果：結(jié)腸癌組織CAP2 mRNA表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05）。結(jié)腸癌組織CAP2蛋白陽性表達率為70.00%，明顯高于癌旁組織的16.00%（P<0.05）。不同分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA及CA19-9水平的結(jié)腸癌組織CAP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Kendall相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌組織中CAP2蛋白陽性表達率與術(shù)前血清CEA、CA19-9均呈正相關(guān)（τ=0.467、0.544，P<0.001）。ROC曲線顯示，CAP2 mRNA、CAP2蛋白對結(jié)腸癌具有一定診斷價值（AUC=0.895、0.770，P<0.001）。結(jié)論：結(jié)腸癌組織CAP2表達水平明顯高于癌旁組織，且其高表達與患者分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA及CA19-9水平密切相關(guān)，提示CAP2參與了結(jié)腸癌發(fā)生、進展，可能成為治療結(jié)腸癌潛在靶點。

【關(guān)鍵詞】 腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2 結(jié)腸癌 CEA CA19-9

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical value of adenylate cyclase related protein 2 （CAP2） in colon cancer tissue and adjacent tissue. Method： The clinical data of 50 patients with colon cancer admitted to our hospital from October 2018 to October 2020 were retrospectively analyzed. The colon cancer tissues and adjacent tissues were taken， real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR） was used to determine the expression of CAP2 mRNA in tissues， and CAP2 protein in tissues by immunohistochemistry. Serum carcinoembryonic antigen （CEA） and CA19-9 levels were measured before operation. The correlation between CAP2 protein expression and clinicopathologic features was analyzed. Kendall correlation was used to analyze the correlation between CAP2 protein and CEA， CA19-9. The diagnostic value of CAP2 in colon cancer was evaluated by receiver operating characteristic （ROC） curve. Result： The expression level of CAP2 mRNA in colon cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P<0.05）. The positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissues was 70.00%， which was significantly higher than 16.00% in adjacent tissues （P<0.05）. There were statistically significant differences in the positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissues with different degrees of differentiation， degree of invasion， TNM stage， lymph node metastasis， preoperative CEA and CA19-9 level （P<0.05）. Kendall correlation analysis showed that the positive expression rate of CAP2 protein in colon cancer tissue was positively correlated with serum CEA and CA19-9 before operation （τ=0.467， 0.544， P<0.001）. ROC curve showed that CAP2 mRNA and CAP2 protein had certain diagnostic value in colon cancer （AUC=0.895， 0.770， P<0.001）. Conclusion： The expression level of CAP2 in colon cancer tissues is significantly higher than that in adjacent tissues， and its high expression is closely related to the degree of differentiation， degree of invasion， TNM stage， lymph node metastasis， preoperative CEA and CA19-9 levels， suggesting that CAP2 is involved in the occurrence and progression of colon cancer， and may become a potential target for the treatment of colon cancer.

[Key words] Adenylyl cyclase related protein 2 Colon cancer CEA CA19-9

First-author’s address： Xingguo County People’s Hospital， Xingguo 342400， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.25.002

結(jié)腸癌（colon cancer）為一類常見消化道惡性腫瘤，早期患者無明顯癥狀，大部分患者確診時已進展至中晚期，預(yù)后較差[1]。因此，尋找有效診斷結(jié)腸癌標志物對防治結(jié)腸癌意義重大[2]。腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2（adenylyl cyclase related protein 2，CAP2）主要分布于人心臟、骨骼組織中，是一類高度保守蛋白質(zhì)[3]。研究表明，CAP2在膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤中呈高表達，且和患者預(yù)后有關(guān)[4]。目前，CAP2在結(jié)腸癌組織表達以及對結(jié)腸癌診斷價值相關(guān)報道較少。為此，本研究回顧性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例結(jié)腸癌患者的臨床資料，測定其癌組織與癌旁組織CAP2 mRNA及蛋白表達，探討CAP2蛋白表達和結(jié)腸癌患者臨床病理特征關(guān)系及對結(jié)腸癌診斷價值，以期為防治結(jié)腸癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年10月-2020年10月本院收治的50例結(jié)腸癌患者的臨床資料。納入標準：術(shù)后病理檢查確診;術(shù)前未行其他治療;臨床資料完整。排除標準：術(shù)中死亡患者;合并肝、腎功能異常;合并其他惡性腫瘤;合并嚴重感染性疾病;合并COPD或其他已知可能對CAP2表達產(chǎn)生影響疾病。50例患者中男32例，女18例;年齡45～82歲，平均（64.51±18.56）歲;腫瘤直徑平均（5.02±1.29）cm;分化程度：15例低分化，26例中分化，9例高分化;浸潤程度：T1、T2期13例，T3、T4期37例;TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期17例，Ⅲ，Ⅳ期33例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。

1.2 方法

1.2.1 臨床病理特征收集 通過查看患者住院期間電子病歷收集性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA、CA19-9水平等臨床病理特征。

1.2.2 標本來源 50例患者均行結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)前1 d清晨抽取3 mL空腹狀態(tài)外周血，3 000 r/min離心處理10 min，分離血清，-80 ℃冷存待檢;術(shù)后留存切除新鮮（離體30 min內(nèi)）結(jié)腸癌組織（癌灶中心部）和癌旁組織（距腫瘤組織8～10 cm處）標本，移入EP管內(nèi)，-80 ℃液氮凍存待檢。每例患者均取癌組織及癌旁組織各1份用于實驗研究。

1.2.3 CAP2 mRNA水平檢測 以Trizol試劑盒提取總RNA，并測定RNA純度、濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參行RT-qPCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系為0.4 μL ROX Reference Dye（50×）、上、下游引物各0.8 μL、2.0 μL cDNA、6.0 μL ddH2O、10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，反應(yīng)條件為95 ℃，10 min→95 ℃，15 s→60 ℃，30 s→72 ℃，60 s，共35個循環(huán)。引物序列見表1。根據(jù)2-ΔΔCt法計算CAP2的mRNA相對表達量[5]。

1.2.4 CAP2蛋白水平檢測 （1）取組織石蠟包塊，常規(guī)切片（4 μm）、脫蠟處理→（2）高壓修復(fù)抗原→（3）阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶→（4）滴加羊血清封閉→（5）滴加采用PBS稀釋至1︰200兔抗人CAP2一抗，PBS沖洗→（6）滴加經(jīng)辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗→（7）滴加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶（SP）→（8）DAB顯色→（9）蘇木素復(fù)染→（10）脫水、透明、封片、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.5 結(jié)果判定 2位資深病理醫(yī)師在僅知道患者性別、年齡等情況下單獨閱片，×400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野，每個視野選擇100個細胞，根據(jù)陽性細胞占比與染色強度乘積（IS值）判定CAP2蛋白表達水平[6]，陽性細胞占比：占比<25%為0分、占比25%～50%為1分、占比51%～75%為2分、占比>75%為3分;染色強度：未染色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分，棕褐色為3分。IS值<3分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。CEA陽性閾值為≥5 μg/L，CA19-9陽性閾值為≥37 kU/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。相關(guān)性行Kendall相關(guān)分析;診斷價值采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）評估，曲線下面積（area under curve，AUC）0.7～0.9時有一定準確性，>0.9準確性較高。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及癌旁組織CAP2 mRNA及蛋白表達情況比較 結(jié)腸癌組織CAP2 mRNA表達水平明顯高于癌旁組織（P<0.05）;結(jié)腸癌組織CAP2蛋白陽性表達率為70.00%，明顯高于癌旁組織的16.00%（P<0.05）。見表2，圖1、2。

2.2 不同臨床病理特征的結(jié)腸癌組織CAP2蛋白表達情況 不同性別、年齡、腫瘤直徑的結(jié)腸癌組織CAP2蛋白表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;不同分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA及CA19-9水平的結(jié)腸癌組織CAP2蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3 結(jié)腸癌組織中CAP2蛋白表達與術(shù)前血清CEA、CA19-9水平相關(guān)性 Kendall相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌組織中CAP2蛋白陽性表達率與術(shù)前血清CEA、CA19-9均呈正相關(guān)（P<0.05），見表4、圖3。

2.5 結(jié)腸癌組織中CAP2表達對結(jié)腸癌診斷價值分析 ROC曲線分析顯示，CAP2 mRNA、CAP2蛋白對結(jié)腸癌的具有一定的診斷價值，AUC分別為0.895、0.770（P<0.05），見表5和圖4、5。

3 討論

研究表明，結(jié)腸癌發(fā)病率、死亡率分別位居胃腸惡性腫瘤第3、4位[7]。目前，尚無早期診斷結(jié)腸癌的有效手段，大多數(shù)患者確診時已無手術(shù)切除可能，因而結(jié)腸癌預(yù)后較差。分析結(jié)腸癌組織異常表達生物分子水平與患者臨床病理特征相關(guān)性，并探討其對結(jié)腸癌診斷價值，可為結(jié)腸癌臨床診治提供新參考[8]。

腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白（adenotide cyclase-related proteins，CAP）最早發(fā)現(xiàn)于酵母研究中，腺苷酸環(huán)化酶協(xié)同調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演關(guān)鍵角色[9]。CAP為具有多種生物活性的高度保守蛋白，在各種病理生理過程中可見CAP表達，其在人體中主要以CAP1、CAP2兩種亞型存在。CAP1廣泛分布于人體內(nèi)，而CAP2主要分布于心肌、骨骼肌中[10-11]。國內(nèi)外眾多研究顯示，CAP2在許多惡性腫瘤中表達異常，如Li等[12]研究中，胃癌組織CAP2蛋白表達明顯升高，且其表達和TNM分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等密切相關(guān);Saker等[13]指出，膠質(zhì)瘤組織CAP2 mRNA及蛋白表達水平均異常升高，CAP2高表達與患者總生存率有關(guān)，對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后具有一定預(yù)測價值。

本研究表明，結(jié)腸癌組織CAP2 mRNA、CAP2蛋白表達水平均明顯高于癌旁組織，且在分化程度低、浸潤程度深、Ⅲ與Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA≥5 μg/L、術(shù)前CA19-9≥37 kU/L的結(jié)腸癌組織中CAP2蛋白陽性表達率更高，說明CAP2高表達和結(jié)腸癌發(fā)生、進展有關(guān)。分析可能機制為：（1）CAP2基因定位于細胞質(zhì)內(nèi)，可通過激活環(huán)磷酸腺苷（c-AMP）和絲裂原-激活蛋白酶激酶（MAPKs）促進結(jié)腸癌細胞增殖;（2）CAP2通過調(diào)節(jié)肌動蛋白及細胞骨架蛋白運動而促進結(jié)腸癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移[14-15]。CEA系提取自結(jié)腸癌、胚胎組織中一種廣譜腫瘤標志物[16];CA19-9系和胰腺癌、結(jié)腸癌、膽囊癌以及胃癌有關(guān)的腫瘤標志物[17]。Kendall相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌組織中CAP2蛋白陽性表達率與術(shù)前血清CEA、CA19-9均呈正相關(guān)（P<0.05），提示CAP2蛋白和臨床常用惡性腫瘤診斷指標具有較強關(guān)聯(lián)性，為分子病理學(xué)結(jié)合血液學(xué)評估結(jié)腸癌發(fā)生、進展提供參考[18-20]。此外，ROC曲線顯示，結(jié)腸癌組織中CAP2 mRNA、CAP2蛋白對結(jié)腸癌具有一定診斷價值（AUC=0.895、0.770，P<0.001）。

綜上所述，結(jié)腸癌組織CAP2表達明顯高于癌旁組織，且其高表達與患者分化程度、浸潤程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前CEA、CA19-9水平密切相關(guān)，提示CAP2參與了結(jié)腸癌發(fā)生、進展，可能成為治療結(jié)腸癌潛在靶點。

參考文獻

[1]郭天安，謝麗，趙江，等.中國結(jié)直腸癌1988-2009年發(fā)病率和死亡率趨勢分析[J].中華胃腸外科雜志，2018，21（1）：33-40.

[2]鐘秀宏，王月華，蔣林哲，等.結(jié)腸癌早期診斷及預(yù)防措施[J].中國慢性病預(yù)防與控制，2019，27（5）：387-390.

[3]楊琴，周嘉偉，張巖，等.CDX2、HNF4α、CAP2蛋白聯(lián)合檢測診斷幽門螺桿菌感染相關(guān)高危胃癌效果[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2020，30（16）：2405-2410.

[4]羅麗華，王蘭青，羅流芳，等.CAP2基因在HCC中的表達及對預(yù)后的評估價值[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2019，36（10）：1932-1934，1938.

[5]張國豪.胃癌中CAP2的異常表達及其機制研究[D].濟南：山東大學(xué)，2019.

[6] Sun Y N，Huang J Q，Chen Z Z，et al.Amyotrophy Induced by a High-Fat Diet Is Closely Related to Inflammation and Protein Degradation Determined by Quantitative Phosphoproteomic Analysis in Skeletal Muscle of C57BL/6 J Mice[J].J Nutr，2020，150（2）：294-302.

[7] Feng H L，Lyu Z J，Zheng J B，et al.Association of tumor size with prognosis in colon cancer：A Surveillance，Epidemiology，and End Results（SEER）database analysis[J].Surgery，2021，169（5）：1116-1123.

[8]姜昊，張茗昱，姜慧杰.結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1在癌癥中的調(diào)控機制及臨床應(yīng)用價值[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2018，98（31）：2533-2536.

[9]崔晨晨，朱一碩，時猛，等.腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1對人腦膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲和黏附的影響[J].江蘇醫(yī)藥，2016，42（10）：1104-1107.

[10]沈東杰，張業(yè)騫，趙恩昊，等.腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白1在胃癌中的表達及意義[J].外科理論與實踐，2017，22（6）：525-530.

[11] Kepser L J，Khudayberdiev S，Hinojosa L S，et al.Cyclase-associated protein 2（CAP2）controls MRTF-A localization and SRF activity in mouse embryonic fibroblasts[J].Sci Rep，2021，11（1）：4789.

[12] Li L，F(xiàn)u L Q，Wang H J，et al.CAP2 is a Valuable Biomarker for Diagnosis and Prognostic in Patients with Gastric Cancer[J].Pathol Oncol Res，2020，26（1）：273-279.

[13] Saker Z，Bahmad H F，F(xiàn)ares Y，et al.Prognostic impact of adenylyl cyclase-associated protein 2（CAP2）in glioma：A clinicopathological study[J/OL].Heliyon，2020，6（1）：e03236.

[14]劉艷紅，陳文霞，屈重行，等.CAP2和EIF4A1在結(jié)腸癌患者中的表達及臨床意義[J].中國衛(wèi)生工程學(xué)，2020，19（5）：673-677.

[15]馬蓉，張新愛，楊洋，等.腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2、纖維連接蛋白1表達與胃癌病理類型及預(yù)后關(guān)系探討[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2021，50（2）：241-244.

[16]孫寧寧，梁育飛，石亮.CA724、CA242聯(lián)合CEA預(yù)測結(jié)腸癌預(yù)后的臨床價值研究[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2019，24（4）：83-85.

[17]張洋，吳慧麗.不同方案對老年晚期結(jié)腸癌血清CEA、AFP、CA19-9、TK1水平及生存周期影響的對比[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2019，39（3）：269-273.

[18]葛思堂，王姍，項武軍，等.腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2在胃癌組織中高表達并與腫瘤進展密切相關(guān)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，39（9）：1052-1058.

[19]林潔，王斌，黃愛民，等.腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2在肝細胞癌中的表達及意義[J].中華肝膽外科雜志，2013，19（4）：287-290.

[20] Mihajlovic M，Ana Ninic A，Sopic M，et al.Association among resistin，adenylate cyclase-associated protein 1 and high-density lipoprotein cholesterol in patients with colorectal cancer：a multi-marker approach，as a hallmark of innovative predictive，preventive，and personalized medicine[J].EPMA J，2019，10（3）：307-316.

（收稿日期：2021-07-26） （本文編輯：田婧）