連作年限對植煙根際土壤化感物質(zhì)積累的影響——以湖北黃棕壤煙田為例①

孫敬國，王昌軍，孫光偉，馮 吉，覃光炯，吳哲寬，余 振，李建平，陳振國

連作年限對植煙根際土壤化感物質(zhì)積累的影響——以湖北黃棕壤煙田為例①

孫敬國，王昌軍，孫光偉，馮 吉，覃光炯，吳哲寬，余 振，李建平，陳振國*

(湖北省煙草科學研究院，武漢 430030)

為明確烤煙不同連作年限對土壤化感物質(zhì)積累的影響，以湖北典型的植煙黃棕壤為例，采用甲醇提取–乙酸乙酯3次萃取-GC-MS檢測方法，分析其根際土壤中化感物質(zhì)的組成和含量。結(jié)果共檢測出化感物質(zhì)5類13種，其中鄰苯二甲酸、對羥基苯甲醛和鄰苯二甲酸二異辛酯等在以往植煙土壤研究中未見報道；化感物質(zhì)含量隨連作年限的延長呈增加趨勢，與種植1 a相比，烤煙連作10 a后，鄰苯二甲酸，苯甲酸，對苯二甲酸，鄰苯二甲酸二異丁酯，鄰、對二叔丁基苯酚含量和3-甲氧基-4-羥基苯甲醛的含量均增加10倍以上，從而可能降低煙葉產(chǎn)質(zhì)量。

烤煙；連作年限；化感物質(zhì)；黃棕壤；湖北

烤煙是忌連作作物，連作造成土壤養(yǎng)分失調(diào)，抑制土壤生物化學過程，影響煙草正常的生長發(fā)育，最終降低烤煙產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。

湖北煙區(qū)是我國重要的煙葉產(chǎn)區(qū)之一，但煙田主要分布在鄂西山地丘陵區(qū)，由于受耕地面積有限、經(jīng)濟利益驅(qū)動和種植條件等因素的制約，烤煙連作現(xiàn)象嚴重。2014年湖北省煙草科學研究院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，湖北省約1/4的煙田連作達10 a以上，由于連作障礙，植煙土壤理化性質(zhì)變差，煙葉產(chǎn)質(zhì)量下降，優(yōu)質(zhì)煙區(qū)不斷萎縮。

連作不同程度地影響了作物的植株形態(tài)、葉片的光合生理特性和活性氧代謝[3]，最終，導致作物生長狀況變差、產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降。因此，連作障礙已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大問題之一[4]，也是國內(nèi)外長期面臨的難題之一[5]。關于連作障礙，有多種學說，其中，化感物質(zhì)被認為是造成連作障礙的原因之一[6]，其被認為是植物中的次生或次級代謝物質(zhì)[7-10]，苯甲酸和對羥基苯甲酸是目前被發(fā)現(xiàn)存在于多數(shù)植物根分泌物中的化感物質(zhì)[11]。

我國對煙草連作障礙的研究報道很多，但主要集中在煙草連作對土壤理化性質(zhì)、煙葉產(chǎn)量及煙葉化學指標等方面，而研究關于植煙土壤化感物質(zhì)的報道很少。于會泳等[12]研究了種煙1 a、連作2 a和連作3 a 0 ~ 20 cm和20 ~ 40 cm土壤根系分泌物的含量變化，發(fā)現(xiàn)含量較高的根系分泌物種類有苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸和鄰苯二甲酸二辛酯，含量較低的種類有4-羥基丁酸和甘油。任夏等[13]研究發(fā)現(xiàn)煙草根系的分泌物對萵苣()幼苗表現(xiàn)出毒性。王永豪[14]研究了涼攀煙區(qū)植煙土壤酚酸類化感物質(zhì)積累特征及其影響因素，發(fā)現(xiàn)溫度、光照、海拔、土壤類型與屬性、輪作方式均會影響植煙土壤酚酸類化感物質(zhì)的積累，酚酸類化感物質(zhì)含量隨著植煙年限的增加均表現(xiàn)先升后降或趨于穩(wěn)定的趨勢。黃棕壤是湖北最主要的植煙土壤，但迄今尚無其化感物質(zhì)方面的報道，為此，本研究針對不同連作年限的黃棕壤煙田，分析其化感物質(zhì)組成和含量及其與連作年限的關系，旨在為連作障礙消減等相關研究提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 供試土壤

研究區(qū)設在湖北省恩施州利川市柏楊壩鎮(zhèn)金樹坪村，植煙土壤為黃棕壤，選取連續(xù)種植烤煙1 a、烤煙連作4 a和10 a的3類代表性煙田，烤煙完全采摘一周后，在每塊代表性煙田內(nèi)采用S形5~8點采集壟體(0~30 cm)的根際土壤，充分混勻后采用“四分法”留取1.5 kg，裝入自封保鮮袋帶回實驗室備用。

1.2 樣品前處理

土壤化感物質(zhì)的提?。悍Q取25 g風干研磨后過20目篩的土壤樣品放在200 ml的三角瓶中，再加入100 ml 80% 的甲醇，搖勻后，在搖床上振動提取3 h，離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到20 ml水相，用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH 至3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相，再用20 ml 8% NaOH溶液提取3次，萃取得到水相用1 mol/L HCl調(diào)至pH 3.0，再次用20 ml乙酸乙酯相提取3次，萃取所獲的乙酸乙酯相，通過減壓濃縮至 1 ml(45 ℃)，過 0.45 μm 濾膜。

1.3 化感物質(zhì)硅烷化處理

參照胡元森[15]硅烷化方法，將乙酸乙酯萃取后的上述濃縮樣品中分別加入 0.25 ml 硅烷化試劑(BSTFA︰吡啶= 5:1)，加蓋密封后于 80 ℃水浴中衍生2 h，待測。

1.4 化感物質(zhì)GC-MS檢測

經(jīng)硅烷化處理后的各組分根系分泌物采用 Agilent 7890A-5975C 進行儀分析測定。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍M/Z 30-600AMU，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度230 ℃。毛細管柱：HP-5MS柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃(2 min)，以6 ℃/min程序升溫至250 ℃(保持 15 min)。載氣為He，流量1 ml/min，進樣量為1 μl。應用 NiST08 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 10.0對數(shù)據(jù)進行了方差分析，采用LSD法進行了多重比較；采用Microsoft Excel 2010對數(shù)據(jù)進行整理分析并繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 化感物質(zhì)GC-MS分析

通過對GC-MS圖譜分析，檢測到13種化感物質(zhì)，根據(jù)化感物質(zhì)的性質(zhì)，分為酸類、脂類、酚類、醛類和醇類物質(zhì)5種物質(zhì)(表1)。

表1 化感物質(zhì)的種類

化感物質(zhì)含量在5.0 μg/g以上的物質(zhì)主要有對羥基苯甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、對羥基苯甲醛和3-甲氧基-4-羥基苯甲醛。

本次檢測出鄰苯二甲酸、對羥基苯甲醛、鄰苯二甲酸二異辛酯等幾種化感物質(zhì)在其他作物研究中曾有報道，如Yu 和Matsui[16]檢測出黃瓜根系分泌物包括苯丙烯酸、對羥基苯甲酸等 11 種酚酸類物質(zhì)。王樹起等[17]檢測出大豆根系分泌物包括鄰甲氧基苯甲酸、肉桂酸和3-硝基鄰苯二甲酸。吳輝和鄭師章[18]檢測出木豆根系分泌物包括番石榴酸、蘋果酸、苯甲酸、肉桂酸等有機酸。Chou和Leu[19]檢測出水稻根系分泌物包括羥基苯甲酸、香豆酸、丁香酸等。胡元森等[20]檢測出黃瓜根系分泌物有對羥基苯甲酸、香草酸等酚酸類物質(zhì)。但這幾種物質(zhì)在煙草研究方面尚未見到公開報道，高欣欣[21]研究指出，烤煙根系分泌物中主要有苯甲酸、肉桂酸、丁二酸、延胡索酸、煙堿、棕櫚酸等物質(zhì)，可見，此次的發(fā)現(xiàn)說明烤煙在生理代謝過程中也能產(chǎn)生這幾種物質(zhì)。

2.2 連作年限對化感物質(zhì)中酸類物質(zhì)的影響

化感物質(zhì)中酸類物質(zhì)主要指一種帶有一個或多個羧基功能團的低分子量碳氫氧化合物。由表2可知，本試驗檢測出酸類物質(zhì)大小含量順序表現(xiàn)為：3-甲氧基-4-羥基苯甲酸>對羥基苯甲酸>對苯二甲酸>苯甲酸>鄰苯二甲酸。

表2 烤煙連作年限對根系土壤酸類物質(zhì)含量的影響(μg/g)

注：表中同列數(shù)據(jù)大寫字母不同表示不同連作年限間差異達<0.01顯著水平，下表同。

酸類化感物質(zhì)含量隨連作年限的延長呈現(xiàn)增加趨勢，連作10 a與種植1 a相比，苯甲酸、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸和對羥基苯甲酸分別增加了46.54倍、46.11倍、36.52倍、4.67倍和2.00倍。有研究表明，連作植煙土壤中羥基苯甲酸、阿魏酸、香草酸等強化感自毒物質(zhì)較不植煙土壤會有成倍增長[22-23]。

酸類化感物質(zhì)主要分布在根際區(qū)域和土壤環(huán)境中，主要通過電離 H+酸化土壤、抑制土壤養(yǎng)分吸收或者促進一些病原菌的產(chǎn)生。有研究表明，隨連作年限延長，連作土壤有明顯變酸的趨勢[14, 24]，土壤酸化則引起礦質(zhì)元素間的拮抗作用和對植物的毒害作用，如在酸性條件下有效磷易被固定而降低其有效性。

土壤中酸類化感物質(zhì)對作物生長有自毒作用，對叔丁基苯甲酸、對羥基苯甲酸等能顯著抑制土壤中氮循環(huán)，并降低土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀以及有機質(zhì)含量，從而對植物生長產(chǎn)生消極影響[25-26]，隨著連作年限的增加，速效氮和速效鉀含量下降[27]。劉艷霞等[28]研究發(fā)現(xiàn)，煙草根系分泌物中的苯甲酸和3-苯丙酸能同時促進土壤中病原菌生長繁殖。可見，化感物質(zhì)中酸類物質(zhì)通過降低土壤pH、降低土壤速效養(yǎng)分含量及促進病原菌的生長等，抑制作物生長。

2.3 連作年限對化感物質(zhì)中酯類物質(zhì)的影響

酯類是羧酸的一類衍生物。由表3可知，酯類物質(zhì)大小含量順序表現(xiàn)為：鄰苯二甲酸二丁酯>鄰苯二甲酸二異辛酯>鄰苯二甲酸二異丁酯。

表3 連作年限對根際土壤中酯類物質(zhì)含量的影響(μg/g)

酯類物質(zhì)含量隨連作年限的延長呈現(xiàn)增加趨勢，連作10 a與種植1 a相比，鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二異辛酯含量分別顯著增加了10.00倍、4.63倍和2.46倍(< 0.01)。

鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯為多次報道過的植物化感物質(zhì)[28-29]。周寶利等[29]在對茄子研究中指出，鄰苯二甲酸二異丁酯對茄子黃萎病菌菌絲及茄子各項農(nóng)藝指標具有“低促高抑”的現(xiàn)象。黃業(yè)昌等[30]對西瓜的研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸二丁酯對西瓜的各項農(nóng)藝指標也同樣表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象。

2.4 連作年限對化感物質(zhì)中酚類物質(zhì)的影響

酚類物質(zhì)是重要的植物次生代謝物質(zhì)之一，主要由植物釋放以及植物殘體和凋落物分解產(chǎn)生[31]。由圖1可知，根際土壤中鄰苯二酚含量介于4.92~39.37 μg/g，鄰、對二叔丁基苯酚含量介于0.57~8.60 μg/g，其含量均隨種植年限的延長而增加，連作10 a與種植1 a相比，分別約增加了8倍和15倍。

土壤中酚類物質(zhì)的積累原因是極其復雜的，既有土壤生物化學方面原因，又與植株中微量元素缺乏有關；既與植物本身的異株克生作用有關，又與土壤微生物活性相關[32]。但其在土壤中的積累會引起植物的化感效應，造成土壤中毒和肥力衰退等問題[33]。

近代土壤學關于土壤腐殖質(zhì)形成理論認為，土壤酚類物質(zhì)經(jīng)多酚氧化酶被氧化為醌，再由醌和含氮化合物結(jié)合變成土壤腐殖質(zhì)。但多酚氧化酶的最適pH為6.3 ~ 7.2[34]，而連作土壤一般為酸性(本研究供試土壤的pH介于4.9~5.6)，酚類物質(zhì)很難由酚變成醌。

烤煙連作過程中，種植1 a土壤酚類物質(zhì)含量遠低于連作10 a，主要是植株根系分泌增加和酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化降解弱化造成。相關研究表明[32]，頭耕土肥力較高，土壤微生物活性強，酚類物質(zhì)可迅速分解為二氧化碳和水；而二耕土和三耕土則因肥力逐漸減低，土壤微生物活性亦相應降低，酚類物質(zhì)會有所積累。酚類物質(zhì)對植物生長的抑制作用，近代植物生物化學將其歸因于吲哚乙酸氧化酶活性的增強，促使吲哚乙酸氧化分解，從而不利于作物生長[35]。

2.5 連作年限對化感物質(zhì)中醛類物質(zhì)的影響

化感物質(zhì)中醛類物質(zhì)主要指一種帶有一個或多個醛基功能團的低分子量碳氫氧化合物。由圖2可知，兩種醛類物質(zhì)含量順序為3-甲氧基-4-羥基苯甲醛>對羥基苯甲醛。

隨著連作年限的增加，兩種醛類化感物質(zhì)含量均呈現(xiàn)增加趨勢，其中對羥基苯甲醛含量介于6.22~87.03 μg/g，3-甲氧基-4-羥基苯甲醛含量介于6.79~237.50 μg/g；連作10 a與種植1 a相比，兩者分別約增加了14倍和35倍。

韓君和羅小勇[36]研究證明一定濃度的對羥基苯甲醛會抑制植物生長，濃度過高甚至會致植物死亡，且雙子葉植物相較于單子葉植物更為敏感。

2.6 連作年限對化感物質(zhì)中醇類物質(zhì)的影響

Rice[7]在對化感物質(zhì)的分類中指出，醇類物質(zhì)也屬于其中一種。本試驗僅檢測出丁醇1類醇類物質(zhì)，其含量隨連作年限的延長呈現(xiàn)上升趨勢(圖3)，由種植1 a的181.61 μg/g增加到連作10 a的496.1 μg/g。

關于丁醇對作物生長作用研究鮮有報道，但同樣作為低分子量醇類甲醇則有相關研究。1985年最早發(fā)現(xiàn)甲醇能夠刺激植物的生長[37]，隨后在單子葉植物[38]和雙子葉植物中[39]得到了證實。但Rowe等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在番茄根部施用5% 的甲醇溶液可顯著抑制番茄幼苗莖部的生長，10% 的甲醇溶液則可導致番茄幼苗死亡。隨后關于辣椒、番茄和矮牽牛的研究中也證實了這一點[41]。由此可初步推斷，土壤溶液中丁醇超過一定濃度也會對作物生長有抑制作用。

3 結(jié)論

湖北烤煙連作根際土壤中化感物質(zhì)包括鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯甲酸等13種，其中酸類物質(zhì)5種，酯類物質(zhì)3種，酚類物質(zhì)2種，醛類物質(zhì)2種和醇類物質(zhì)1種。

烤煙連作根際土壤中化感物質(zhì)含量隨連作年限的延長呈現(xiàn)增加趨勢，其中鄰苯二甲酸，苯甲酸，對苯二甲酸，鄰苯二甲酸二異丁酯，鄰、對二叔丁基苯酚含量和3-甲氧基-4-羥基苯甲醛增加較為顯著。

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Effects of Tobacco Continuous Cropping on Allelochemicals Accumulation in Rhizosphere Soil ——A Case Study of Yellow Brown Soil of Hubei

SUN Jingguo, WANG Changjun, SUN Guangwei, FENG Ji, QIN Guangjiong, WU Zhekuan, YU Zhen, LI Jianping, CHEN Zhenguo*

(Hubei Academy of Tobacco Science, Wuhan 430030, China)

Allelochemicals are secondary metabolites or transformants released from plants into the environment and can influence the nearby plants harmfully or beneficially. In this study, the allelochemicals in typical yellow brown soils with different years of tobacco continuous cropping were detected by GC-MS after being extracted by methanol and ethyl acetate respectively. The results showed that in total 13 kinds of allelochemicals were detected, including 5 kinds of the acids, 3 kinds of the esters, 2 kinds of the phenolics, 2 kinds of the aldehydes and 1 kind of the alcohols, among of which, phthalic acid, p-hydroxybenzaldehyde and di (2-ethylhexyl) phthalate were first reported in tobacco study. The contents of allelochemicals in rhizosphere soil showed an increasing trend with the year of tobacco continuous cropping. Comparing with 1 a of tobacco planting, the contents of phthalic acid, benzoic acid, terephthalic acid, diisobutyl phthalate, 3,4-di-tert-butyl-pheno and 3-Methoxy-4-formylphenol increased more than 10 times under 10 a continuous cropping, which could possibly reduce or deteriorate the yield and quality of tobacco.

Flue-cured tobacco; Continuous cropping year; Allelochemicals; Yellow-brown soil; Hubei

S151.9

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.020

孫敬國, 王昌軍, 孫光偉, 等. 連作年限對植煙根際土壤化感物質(zhì)積累的影響——以湖北黃棕壤煙田為例. 土壤, 2021, 53(1): 148–153.

中國煙草總公司重點項目(110201902005)資助。

(hbskysl@163.com)

孫敬國(1981—)，男，山西長治人，高級農(nóng)藝師，主要從事煙田土壤酸化改良及連作障礙消減等方面研究。E-mail: sunjg596@hotmail.com