有機(jī)肥施加對紅壤中反硝化細(xì)菌nirK基因多樣性影響①

張晨陽，滕齊輝，曹 瀅，崔中利，李順鵬，曹 慧

有機(jī)肥施加對紅壤中反硝化細(xì)菌基因多樣性影響①

張晨陽，滕齊輝，曹 瀅，崔中利，李順鵬，曹 慧*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

為了解有機(jī)肥施用對于紅壤中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，設(shè)置了4個處理：CK(不施肥)、LM(低量有機(jī)肥)、ML(高量有機(jī)肥+石灰)和HM(高量有機(jī)肥)進(jìn)行研究，并通過末端限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)和克隆文庫的DNA測序估計(jì)了基因的多樣性。結(jié)果表明：各處理分別挑選的288個陽性克隆子可分為78個類型，各處理文庫中的優(yōu)勢類群屬于同一種類型，在CK處理中的占比為51%，在其他3個處理中的占比依次為33%、32% 和27%。4個文庫之間兩兩的相似性在37.50% ~ 45.34%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，51個OTUs測序結(jié)果中6個OTUs與蒼白桿菌屬的相似性最高，占測序總數(shù)的11.8%；其余45個OTUs屬于未培養(yǎng)類型，占測序總數(shù)的88.2%。有機(jī)肥添加有助于提高基因的多樣性，并且出現(xiàn)了紅壤原始環(huán)境中未出現(xiàn)的反硝化細(xì)菌類型。

反硝化細(xì)菌；基因；RFLP 分析；紅壤；有機(jī)肥施加

紅壤在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布，是我國最主要的土壤類型之一，在全國范圍內(nèi)共有148萬km2，占耕地總面積的36%[1]。紅壤由于風(fēng)化和淋溶作用，使得土壤的酸性較強(qiáng)、養(yǎng)分匱乏，缺乏許多營養(yǎng)元素，尤其是氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鋅和銅[2-3]。為了提高紅壤的肥力，通常采用有機(jī)肥來改善其質(zhì)量，添加到土壤中的有機(jī)肥可以改善土壤性質(zhì)，例如土壤團(tuán)聚體、持水能力、土壤容重和肥力等[4-6]。康國棟等[7]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥的施加可以促進(jìn)紅壤有機(jī)質(zhì)活性組分的提高，對于土壤的培肥至關(guān)重要。石灰也常常被用來修復(fù)酸性土壤。在熱帶地區(qū)，施用少量的石灰就可以緩解鋁毒性和/或鈣缺乏狀況，從而增加作物產(chǎn)量[8]，石灰的施加對于紅壤中鉀的含量也有一定的影響[9]。由于紅壤在干濕環(huán)境下的特殊性質(zhì)，容易滋生反硝化微生物[10]，而施肥被認(rèn)為是土壤微生物演替的重要驅(qū)動因素[11]，包括化肥和有機(jī)肥在內(nèi)的氮肥施用，可以促進(jìn)硝化作用與反硝化作用，導(dǎo)致氮素的流失[12-14]。因此研究有機(jī)肥添加對于紅壤中反硝化細(xì)菌的影響有較大意義。

反硝化作用是氮循環(huán)中的關(guān)鍵組分，是在微氧或無氧環(huán)境中一種由微生物介導(dǎo)的逐步還原過程，其中硝酸鹽(NO– 3)依次還原為亞硝酸鹽(NO– 2)，一氧化氮(NO)，一氧化二氮(N2O)，最后還原為氮?dú)?N2)[15]。反硝化作用的4個生物過程對應(yīng)著4種在反硝化過程中互相獨(dú)立的關(guān)鍵酶，分別是硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶，對應(yīng)的功能基因分別為、、和。而亞硝酸還原酶參與的反應(yīng)是區(qū)分硝酸鹽呼吸菌和反硝化細(xì)菌的標(biāo)志性反應(yīng)，同時這一步反應(yīng)還會釋放出臭氧被還原的催化劑氣體，因此是反硝化過程中的重要限速步驟[16-18]。亞硝酸還原酶具有兩種由不同基因(和)編碼的結(jié)構(gòu)形態(tài)，許多研究將這兩種基因用于研究反硝化細(xì)菌群落。研究發(fā)現(xiàn)，含有基因的微生物以假單胞菌(sp)為主，而基因則存在于很多分布較遠(yuǎn)的微生物中[17]；另外，也有研究發(fā)現(xiàn)基因?qū)Νh(huán)境因子的變化相較于基因更為敏感，環(huán)境因子如NO– 3、全氮、含水量等的改變會影響含有基因的反硝化細(xì)菌的多樣性[19-20]。因此，研究環(huán)境中的基因可以更為真實(shí)地了解環(huán)境中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的情況，也有助于了解環(huán)境因子對于反硝化細(xì)菌群落的綜合作用。

有研究者發(fā)現(xiàn)，土壤中由于反硝化作用而損失的氮肥占其總量的20% ~ 30%[21]。氮肥是土壤氧化亞氮排放的主要來源，而這種氣體的排放導(dǎo)致全球氣候發(fā)生變化[22]，通過反硝化和氨揮發(fā)損失的氮素量隨氮肥用量的增加而增加[23]。在之前的研究中研究者對有機(jī)肥的施用方式與有機(jī)肥的類型對于反硝化細(xì)菌的影響進(jìn)行了研究[12-14, 24]，但是對于紅壤中施用有機(jī)肥對于含有基因的反硝化細(xì)菌影響尚無定論。本研究利用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)研究長期(4年)施加有機(jī)肥和石灰的紅壤中基因群落結(jié)構(gòu)的改變，探討紅壤地區(qū)反硝化細(xì)菌的多樣性及其重要影響因素，為紅壤陸地生態(tài)系統(tǒng)研究提供部分參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

采樣地點(diǎn)位于江西省鷹潭市的中國科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站內(nèi)(116°55′30″ E，28°15′20″ N)，試驗(yàn)土壤為第四紀(jì)紅黏土發(fā)育的紅壤(黏化濕潤富鐵土)，試驗(yàn)小區(qū)為長2 m×寬2 m的水泥池，自2002年起，每年種植一季玉米(山東登海一號)。試驗(yàn)使用養(yǎng)殖廠豬糞作為有機(jī)肥，設(shè)置4個處理：①CK，不施肥；②LM，低量有機(jī)肥，折合純N 150 kg/(hm2·a)；③ML，高量有機(jī)肥+石灰，折合純N 600 kg/(hm2·a) + 石灰1 000 kg/(hm2·a) (考慮到石灰處理對于土壤的影響及作用時間，2002年和2005年各施加一次石灰)；④HM，高量有機(jī)肥，折合純N 600 kg/(hm2·a)。每處理3個重復(fù)。2006年7月下旬收獲作物一周后進(jìn)行土壤樣品采集，每個小區(qū)土壤樣品均為9點(diǎn)混合樣品，用不銹鋼土鉆(直徑2 cm) 鉆取0 ~ 15 cm的土樣，用四分法留取土樣，低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，去除石頭和植物根系，取一部分混合土壤樣品風(fēng)干后過篩(<2 mm)用于理化性質(zhì)測定；另取一部分保存于–70℃冰箱中用于土壤微生物總DNA提取。試驗(yàn)土壤理化性質(zhì)參見文獻(xiàn)[25]。

1.2 供試菌株與試劑

本試驗(yàn)除大腸桿菌DH10B、限制性內(nèi)切酶HhaI和RsaI購自大連寶生物工程有限公司外，其余所有在試驗(yàn)中使用的菌株和試劑均與本實(shí)驗(yàn)室之前的研究中使用的一致[26]。

1.3 反硝化細(xì)菌nirK基因片段的擴(kuò)增與克隆文庫的構(gòu)建

使用Zhou等[27]提出的直接提取法對土壤樣品總DNA進(jìn)行提取。采用引物(5'- GGMATGG-TKCCSTGGCA -3')和(5'- GCCTCGATCAGR-TTRTGG -3')用于直接擴(kuò)增土壤總DNA中的基因片段[28]。PCR反應(yīng)體系與汪峰等[26]研究中使用的體系一致，PCR擴(kuò)增程序采用“降落”PCR 程序。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃；后再接50℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環(huán)，每個循環(huán)升0.5℃； 52℃退火30 s，72℃延伸1 min，10 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的條帶大小和濃度，為了避免單次擴(kuò)增帶來的偏差并獲得足夠的PCR產(chǎn)物用于克隆，對每個DNA樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增，然后合并使用回收試劑盒回收純化目的片段，并根據(jù)制造商的方案克隆到pMD18-T載體中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH10B中，使用藍(lán)白斑篩選，從4個處理中各挑選出288個陽性克隆子，建立基因片段的克隆文庫，所有的克隆文庫驗(yàn)證后轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加等體積的30% 甘油混合后于–70℃保存。

1.4 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析

直接挑取陽性轉(zhuǎn)化子菌體，使用菌體PCR的方式利用上述引物再次進(jìn)行片斷的擴(kuò)增，分別用HhaI和RsaI兩種限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切(37 ℃，3 h)。使用8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，經(jīng)硝酸銀染色、凝膠成像整理后即為反硝化基因指紋圖譜。所得到的指紋圖譜用上海山富科技服務(wù)有限公司的(Bio-science)GIS凝膠成像分析系統(tǒng)分析并輔以人工分析。以基因片段多態(tài)圖像為基礎(chǔ)進(jìn)行聚類，將兩種酶切產(chǎn)物帶型一致的基因型分為一類，每一個基因型即為一個操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)。

通過統(tǒng)計(jì)分析方法對4個處理進(jìn)行多樣性比較，計(jì)算得到群落的文庫覆蓋率 (Coverage C)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、均勻度和豐富度指數(shù)。

1.5 序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對4個處理文庫中的代表性酶切克隆子進(jìn)行了測序，共挑取54個克隆子，測定其插入序列全長(515 bp左右)。測序工作由上海生工生物技術(shù)公司完成，測序引物為pMD18-T vector多克隆位點(diǎn)兩端的通用引物(primer RV-M 和primer M13-4)。將測序獲得的序列提交至NCBI(National Center for Biote-chnology Information)，得到登錄號為EU790823 ~ EU790873，使用BLAST對GenBank(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)已經(jīng)存在的序列進(jìn)行同源性比對。經(jīng)過嵌合體檢查后，將確定為反硝化基因的序列用BioEdit v7.0.1轉(zhuǎn)換成FASTA 格式。同時，根據(jù)BLAST同源性比對的結(jié)果，從核酸數(shù)據(jù)庫中下載同源性高的序列以及不同分類來源的代表性序列，然后按照汪峰等[26]研究中的方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，從而進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 nirK基因文庫的酶切類型

對CK、LM、ML和HM 4個處理的土壤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建基因克隆文庫，通過RFLP分析發(fā)現(xiàn)，這些基因具有豐富的物種多樣性。根據(jù)獲得的清晰RFLP圖譜，各個處理分別挑選的288個克隆子可分為78種類型，并將這78種類型分別命名為CK-A至CK-N，LM-A至LM-S，ML-A至 ML-T和HM-A至HM-Y，4個克隆文庫聚類比例見表1。CK文庫中占比最大的類群即為其優(yōu)勢類群，占比達(dá)到了51%，超過了CK文庫總數(shù)的一半，LM文庫中優(yōu)勢類群所占比例為33%，ML文庫中優(yōu)勢類群的比例為32%，HM文庫中優(yōu)勢類群占總數(shù)的27%。優(yōu)勢類群是這4個文庫中共有的，并且其相對含量隨著有機(jī)肥的添加而逐漸降低；在4個文庫中出現(xiàn)了部分特有的類型，從各處理類群數(shù)也可看出隨著肥力的增加反硝化細(xì)菌的類群是逐漸增加的。

表2是4個基因文庫之間的群落相似性矩陣，通過相似性比較可以看出不同的處理導(dǎo)致群落間變化的差異程度。4個文庫兩兩之間的相似性在37.50% ~ 45.34%；隨著有機(jī)肥添加量的增加相似性值下降。說明整體上4個處理依舊存在著很大的共性部分，但有機(jī)肥的添加可以改變反硝化細(xì)菌群落。

2.2 nirK基因文庫的多樣性指數(shù)

圖1是4個基因文庫的豐富度曲線，從圖1中可以看出，4個文庫的趨勢線已經(jīng)趨于平緩，說明庫容量已經(jīng)達(dá)到了比較飽和的程度。由表3可知，4個文庫的文庫覆蓋率分別為88.23%(CK)、86.57% (LM)、87.84%(ML)和80.82%(HM)，均大于80%，說明本研究所建立的基因文庫可以較好地代表紅壤環(huán)境中反硝化細(xì)菌的群落組成。

從4個文庫中的多樣性指數(shù)可以看出，紅壤中存在著豐富的反硝化微生物，各文庫之間多樣性指數(shù)差異比較明顯。CK處理的基因多樣性指數(shù)最低，HM處理的最高，而LM和ML處理的多樣性指數(shù)比較接近，反硝化微生物的多樣性隨肥力程度的提高而逐漸增加。從文庫的均勻度和豐富度來看，與文庫的多樣性指數(shù)趨勢一致，說明有機(jī)肥量的增加使得反硝化細(xì)菌變得更加豐富且使得各類反硝化微生物趨向于更均勻。香農(nóng)指數(shù)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析結(jié)果見表4，僅碳氮比與香農(nóng)指數(shù)之間呈顯著正相關(guān)，其他各環(huán)境因子與香農(nóng)指數(shù)之間無顯著相關(guān)關(guān)系。

表1 4個nirK克隆文庫酶切分型

表2 4個nirK基因文庫之間的群落相似性矩陣

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與系統(tǒng)發(fā)育分析

本文將測序的54個OTUs通過NCBI的BLAST比對去除了3個假陽性結(jié)果，得到51個正確的基因序列，在Genbank上選擇了部分與測定序列較為接近的序列，通過BioEdit 和Mega軟件用這些序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，測序的基因彼此之間的相似性在60%~100%，與已知序列進(jìn)行同源性比較，沒有達(dá)到100% 的，說明這些序列可能是之前未被描述過的基因序列；這些OTUs主要被分為3個簇，大部分的OTUs出現(xiàn)在cluster 1中，占總克隆數(shù)的78.4%，HM處理在cluster1中占15%，其他3個處理各占25% ~ 30%，同時還發(fā)現(xiàn)在cluster 2和cluster 3中均未出現(xiàn)CK樣品中的克隆子，其他3個處理各占30% 左右；紅壤中反硝化細(xì)菌具有高度多樣性，51個OTUs分屬于蒼白桿菌屬(sp.)和未培養(yǎng)的細(xì)菌，并且絕大多數(shù)與未培養(yǎng)細(xì)菌的相似度更高。

表3 4個nirK基因文庫的群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)

表4 香農(nóng)指數(shù)與環(huán)境變量的Pearson相關(guān)性

注：*表示在<0.05 水平(雙側(cè))顯著相關(guān)，=4。

3 討論

反硝化過程是由微生物將環(huán)境中被固定的氮素重新釋放到大氣中，從而實(shí)現(xiàn)自然界生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)過程，是自然界氮素循環(huán)的重要組成部分[29]。研究表明，反硝化作用產(chǎn)生了大量的溫室氣體，如NO和N2O[30]，導(dǎo)致地球生物圈中氮素?fù)p失較大，自然環(huán)境的補(bǔ)給量遠(yuǎn)小于其損失程度，所以全球氮素預(yù)算處于極不平衡的狀態(tài)[31-33]。紅壤由于其養(yǎng)分匱乏、有機(jī)物質(zhì)含量較低，因此向紅壤中施肥是提高紅壤經(jīng)濟(jì)效益的有效方式[2,5]，但是關(guān)于有機(jī)肥添加對于紅壤中含有基因的反硝化細(xì)菌群落影響的研究較少。本研究以基因作為分子標(biāo)記，采用PCR-RFLP方法研究了多種有機(jī)肥添加處理對于紅壤反硝化群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響，結(jié)果表明，4個不同處理文庫之間的群落結(jié)構(gòu)組成有較大的差異，兩兩處理之間的相似性在37.50% ~ 45.34%。有研究認(rèn)為當(dāng)群落相似性大于60% 時屬于相似性較好的群落[34]，而本試驗(yàn)中相似值均小于60%，說明這4個基因文庫之間的相似度均較低。在4個基因文庫中優(yōu)勢類群所占比例依次為CK 51%、LM 33%、ML 32% 和HM 27%，而各文庫中基因類群的數(shù)量依次為14種、19種、20種和25種。通過對香農(nóng)指數(shù)和多樣性指數(shù)等分析發(fā)現(xiàn)，各指數(shù)的變化情況相同，均為HM>ML>LM>CK，和圖1中展示的結(jié)果相一致。Yang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，氮含量較高的土壤有助于增加含有亞硝酸鹽還原酶基因的反硝化菌的豐度；Chen等[36]研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)物質(zhì)的添加可以增加反硝化菌群的豐度，并認(rèn)為有機(jī)質(zhì)的添加和碳含量的增加對于土壤中微生物的生存和繁衍具有積極影響。有機(jī)物質(zhì)的添加可以提供豐富和平衡的營養(yǎng)物質(zhì)(如高有機(jī)碳和一些無機(jī)鹽)，有利于氮循環(huán)中涉及的微生物的生長，本研究結(jié)果的趨勢與之相同。

反硝化細(xì)菌群落香農(nóng)指數(shù)與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，僅碳氮比與香農(nóng)指數(shù)呈顯著正相關(guān)，其他環(huán)境因子與香農(nóng)指數(shù)相關(guān)性不顯著，與Yang等[37]的研究結(jié)果不符。而鄧玉峰等[38]研究發(fā)現(xiàn)石灰的施加會降低細(xì)菌的數(shù)量，這可能導(dǎo)致了ML處理中反硝化細(xì)菌類群數(shù)量的減少，但ML處理各環(huán)境因子的值仍然較高，因此可能導(dǎo)致相關(guān)性檢驗(yàn)不顯著。

從本研究系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，不同的有機(jī)肥添加處理土壤中反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要由-變形菌綱的蒼白桿菌屬(sp)和未培養(yǎng)的細(xì)菌組成，其中與未培養(yǎng)細(xì)菌相關(guān)的片段占到總數(shù)的88.2% 以上，與李剛等[39]的研究結(jié)果一致，但本研究中未培養(yǎng)細(xì)菌相關(guān)的比例更高，說明紅壤中出現(xiàn)了豐富的反硝化細(xì)菌，這可能與紅壤的性質(zhì)有關(guān)系。紅壤地區(qū)降水量豐富，雨季土壤常處于淹水的環(huán)境，干旱季節(jié)土壤又極易板結(jié)、不透氣，時常處于厭氧的環(huán)境，有利于滋生反硝化微生物，導(dǎo)致反硝化作用的進(jìn)行，反硝化基因也表現(xiàn)出豐富的程度[10]。大量研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境下反硝化細(xì)菌許多都屬于未培養(yǎng)細(xì)菌。Henry等[40]對56個基因序列系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因序列與目前已知的可培養(yǎng)反硝化微生物的基因序列不同，Yoshida等[41]研究水稻土中含有基因的反硝化細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)菌都與未培養(yǎng)細(xì)菌相關(guān)。本研究系統(tǒng)發(fā)育樹分析將同屬于蒼白桿菌屬的兩個種聚成兩類，這可能是因?yàn)檫@兩個種中基因的分類較遠(yuǎn)。有研究者對和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，基因與16S rRNA基因不一致[42-43]。與蒼白桿菌屬聚類較近的多為CK處理中的克隆子，然后依次為LM、ML和HM處理，這說明不同的施肥條件改變了反硝化細(xì)菌的組成，但是具體的相關(guān)關(guān)系仍需要更為先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

通過向紅壤中添加有機(jī)肥可以增加含基因的反硝化細(xì)菌多樣性，并且反硝化細(xì)菌的類群是隨著有機(jī)肥的添加量增加而增加，但是向添加有機(jī)肥的處理中添加石灰可以降低反硝化細(xì)菌類群數(shù)量；相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹表明，有機(jī)肥的添加改變了紅壤中反硝化細(xì)菌的群落組成，但是并未改變反硝化細(xì)菌的優(yōu)勢菌群類型，未培養(yǎng)細(xì)菌是紅壤中反硝化細(xì)菌的主要組成部分。

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Effect of Organic Manure Application on Diversity ofGene in Denitrifying Bacteria in Red Soil

ZHANG Chenyang, TENG Qihui, CAO Ying, CUI Zhongli, LI Shunpeng, CAO Hui*

(Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to understand the effect of organic manure application on the structure of denitrifying bacteria in red soil, four treatments were designed and compared: 1) CK, no manure; 2) LM, low organic manure; 3) ML, high organic manure + lime; and 4) HM, high amount organic manure. The diversity of thegene was estimated by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and DNA sequencing of the cloned library. The results showed thatthe 288 clones selected in each treatment can be divided into 78 clusters, and the dominant groups in eachlibrary were of the same cluster, accounting for 51% of the CK, while the other three treatments were 33%, 32% and 27%, respectively. The similarity between the four libraries was between 37.50% and 45.34%. The phylogenetic tree analysis of the 51 OTUs showed that 6 OTUs had the highest similarity withsp., accounting for 11.8% of the total number of sequencing. The remaining 45 OTUs belonged to the uncultured cluster, accounting for 88.2% of the total number of sequencing. Organic manure addition increased the diversity of thegene, but some types of denitrifying bacteria didn’t appear in the original red soil environment.

Denitrifying bacteria;gene; RFLP; Red soil; Application of organic manure

Q938.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.010

張晨陽, 滕齊輝, 曹瀅, 等. 有機(jī)肥施加對紅壤中反硝化細(xì)菌基因多樣性影響. 土壤, 2021, 53(1): 72–79.

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41371262；40871125)資助。

(hcao@njau.edu.cn)

張晨陽(1994—)，男，山西長治人，碩士研究生，研究方向?yàn)橥寥牢⑸锷鷳B(tài)學(xué)。E-mail: 1044112375@qq.com