亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)可能是酸性土壤硝化作用的重要驅動者①

李文興，鄭曼曼，王 超，沈仁芳

亞硝化球菌屬()可能是酸性土壤硝化作用的重要驅動者①

李文興1,2，鄭曼曼1,2，王 超1*，沈仁芳1,2

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049)

選擇初始pH相近的兩個酸性土壤 (JX-3和JX-7) 樣品進行培養(yǎng)試驗，探討了氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在酸性土壤硝化過程中所發(fā)揮的作用。結果顯示，經(jīng)過50 d的培養(yǎng)，JX-7樣品硝化速率顯著高于JX-3，且明顯降低土壤pH。培養(yǎng)后，兩個土壤樣品AOB豐度均增加，但樣品間沒有顯著差異；JX-7土壤AOA豐度顯著增加，而JX-3無顯著變化。兩個土壤樣品AOA群落組成本身存在分異，但對于同一樣品培養(yǎng)前后均無顯著分異；AOB群落組成在兩土壤間沒有分異，但培養(yǎng)前后分別有分異。培養(yǎng)后，JX-7樣品中AOA優(yōu)勢屬和某些未知微生物的個別OTUs絕對豐度顯著增加，而兩樣品AOB中屬的一些OTUs的絕對豐度均顯著增加。因此，所研究的酸性土壤樣品中AOA是硝化作用的主要貢獻者，而且AOA主要通過提高屬中個別OTUs的豐度，而不是整個群落來調(diào)控硝化作用。

；氨氧化古菌；絕對豐度；硝化速率；酸性土壤

我國酸性土壤(pH<5.5) 面積為217.96萬km2，占全國土地面積的22.7%，主要分布在南方熱帶和亞熱帶地區(qū)，具有豐富的光、熱、水、土和生物資源[1]。近年來，由于氨態(tài)氮肥過量施用和工業(yè)化導致的酸沉降等人為活動強度的不斷增加，土壤酸化程度在加劇，酸化面積在不斷擴大[2]，嚴重限制了土壤的生產(chǎn)潛力，并對生態(tài)環(huán)境造成嚴重危害。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，主導的硝化作用不僅是元素生物地球化學循環(huán)的重要組成部分[3-5]，也是土壤酸化的重要驅動者[2]，因此越來越受到研究人員的重視。經(jīng)典硝化作用分為兩步，第一步是氨氧化過程，即將氨(NH3)氧化為亞硝酸根(NO– 2)；第二步是亞硝酸鹽氧化過程，即將NO– 2氧化為硝酸根NO– 3)；其中氨氧化過程是硝化作用的限速步驟，在氮循環(huán)中扮演著重要角色[6]。上百年來，氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)一直被認為是土壤氨氧化過程的主要驅動者[7]。但是，2005年K?nneke等人[8]在海洋中分離出一株可以進行氨氧化過程的泉古菌，其屬于化能無機自養(yǎng)代謝氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)。進一步研究證實，AOB和AOA都參與氨氧化過程，其貢獻能力取決于特定的環(huán)境和微生物類群組成[9-10]。例如，AOA和AOB對土壤pH和底物NH3的敏感性不同[11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，由于AOA和AOB在4種環(huán)境(稻田、河口、淺灘和濕地)中群落組成明顯不同，它們的氨氧化活性差異較大。基于目前對土壤酸化的高度重視，研究認為AOA，尤其是奇古菌和泉古菌，是酸性土壤氨氧化過程主要驅動者，原因在于其能夠較好地適應酸性土壤的環(huán)境特點，特別是較低土壤pH[11]。然而，一些研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤中AOB的某些種屬類群(如bacteria和cluster 8a等)也可能發(fā)揮重要作用[13-14]。即使在相似的土壤pH下，一些特定的AOA或AOB類群也表現(xiàn)較大差異的功能。例如，AOA中Group 1.1a的古菌微生物類群在酸性水稻土壤(pH = 4.8)和森林土壤(pH = 4.2)氨氧化過程中發(fā)揮重要的作用，而AOB中cluster 3-like的微生物類群主要參與酸性旱作土壤(pH = 4.7)中的氨氧化過程[15]?？梢?，由于受多種因素的影響，AOB和AOA對酸性土壤氨氧化過程的相對貢獻仍存在較大爭議，發(fā)揮作用機理需要進一步闡明。

早期研究認為酸性土壤硝化作用很弱，但是目前很多證據(jù)證明了在某些特定的酸性土壤中，其硝化作用也很強烈?；诒緦嶒炇仪捌趯ξ覈戏剿嵝约t壤區(qū)采集的51個土壤樣品[16]，發(fā)現(xiàn)樣品間硝化作用潛能存在較大差異，本研究選擇其中兩個pH相近且硝化能力差異較大的土壤樣品，期望通過測定氨氧化微生物的豐度和群落組成，分析AOA和AOB在酸性土壤硝化過程中所扮演的角色，并探索發(fā)揮作用的機制。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

培養(yǎng)試驗所用酸性土壤樣品分別采自江西鷹潭柑桔園和旱地農(nóng)田，根據(jù)我們前期研究，依次命名為JX-3和JX-7[16]。兩個土壤樣品起始基本理化性質(zhì)見表1。

表 1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.2 土壤硝化作用測定

稱取50 g過2 mm篩的風干土放于250 ml培養(yǎng)瓶中，加去離子水至最大持水量的40%，用塑料膜將培養(yǎng)瓶封口。于28 °C環(huán)境中恒溫黑暗預培養(yǎng)7 d后，按照N 250 mg/kg干土加入硫酸銨，最后將土壤水分含量調(diào)至最大持水量的60%，用塑料膜將培養(yǎng)瓶封口，于28 °C環(huán)境中恒溫黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每隔1 d采用稱重法補水1次，使土壤水分保持基本不變。培養(yǎng)開始后的0 d和50 d分別取樣。

土壤pH采用風干土測定，用pH計(Mettler Toledo FE20, 上海, 中國)在土水比為1︰2.5的條件下測定；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用鮮土測定，2 mol/L氯化鉀浸提后，用流動分析儀(San++, Skalar, Holland)測定。

1.3 土壤DNA提取和基因豐度測定

稱取0.50 g新鮮土壤樣品，采用Fast?DNA SPIN Kit (MP Biomedicals, CA, USA)提取土壤DNA，并采用PowerClean?DNA Clean-up Kit (MoBio, CA, USA)純化土壤DNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。每個土壤樣品連續(xù)提取兩次DNA，將其混合在一起作為一個土壤樣品DNA。

在LightCycler 480 Real-Time定量PCR儀(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)上進行實時熒光定量PCR，測定與氨氧化過程相關基因(古菌和細菌)的豐度。氨氧化微生物功能基因古菌和細菌擴增引物分別為Arch-amoA-F (5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′)/Arch-amoA-R (5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT-3′)[8]和Bac-amoA- F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′) / Bac-amoA-R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[17]。定量PCR反應體系為10 μl，包括5 μl TB GreenTM Premix Ex Taq? (2x)，上下引物各0.4 μl，2 μl DNA模板(稀釋20倍)，2.2 μl超純無菌水。定量PCR反應條件如下：95 °C預變性30 s，95 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，40個循環(huán)。每個土壤DNA樣品擴增3次。對含有目的基因的質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，于同一條件下進行qPCR，得到標準曲線。古菌和細菌的qPCR擴增效率分別為94.0%(2= 0.999)和102.5% (2= 0.991)。

1.4 AOA和AOB中amoA基因高通量測序

以提取的土壤DNA為模板，采用Arch-amoA- F/R和Bac-amoA-F/R引物對目的片段進行PCR擴增。獲得PCR產(chǎn)物后，對其進行純化、建立文庫和文庫質(zhì)檢，最后利用454 GS FLX+儀器進行測序。所有原始下機數(shù)據(jù)首先運用QIIME軟件識別疑問序列并去除[18]；隨后通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH檢查并剔除嵌合體序列。剩余的高質(zhì)量序列利用UCLUST序列比對工具按照97% 的相似度劃分操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)，每個OTU中數(shù)量最多的序列被選為該OTU的代表序列[19]。最后將所有代表序列與NCBI GenBank中具有分類信息的序列相比對，獲得每個OTU所對應的分類學信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

土壤pH變化量是培養(yǎng)開始后50 d的土壤pH減去0 d的pH。土壤硝化速率是單位時間內(nèi)土壤硝態(tài)氮含量的增加量，即培養(yǎng)開始后50 d的土壤硝態(tài)氮含量與0 d土壤硝態(tài)氮含量的差值除以50 d[20]。

AOA和AOB前20位OTUs的絕對豐度是高通量測序數(shù)據(jù)中相對豐度前20位OTUs的相對豐度乘以對應基因的總豐度。

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2019，并采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析檢驗AOA和AOB中amoA基因豐度的差異顯著性。多重比較采用鄧肯(Ducan)法，差異顯著性水平為0.05。采用獨立樣本-檢驗分析供試土壤之間土壤pH變化量、硝化速率，同一供試土壤下培養(yǎng)開始后0 d和50 d之間微生物前20位OTUs絕對豐度差異顯著性。應用R語言vegan包對微生物群落結構進行主成分分析(principal component analysis, PCA)。作圖使用Origin 2019軟件。

2 結果

2.1 土壤pH變化量和硝化速率

培養(yǎng)50 d后，JX-3土壤pH基本穩(wěn)定不變，而JX-7土壤pH顯著下降(圖1A)。兩個土壤硝化速率存在顯著差異，即JX-7 (0.78 mg/(kg·d)) > JX-3 (0.11 mg/ (kg·d)) (圖1B)?？梢?，土壤硝化作用越強，土壤酸化越明顯，但不同土壤間存在較大差異。

2.2 土壤AOA和AOB的amoA基因豐度

兩個土壤本身AOB的基因豐度存在顯著差異，但AOA并沒有顯著差異(圖2)。培養(yǎng)50 d后，JX-7土壤AOA的基因豐度顯著增加(圖2A)，但是JX-3無顯著增加。兩個土壤AOB的基因豐度也均顯著增加，但樣品間無明顯差異(圖2B)?？梢酝茰y，AOA可能是硝化作用的主要驅動者。

2.3 土壤AOA和AOB群落分析

土壤氨氧化微生物群落組成分析結果(圖3)顯示，酸性土壤AOA群落主要的菌屬是和；AOB群落主要的菌屬是、、和。這些菌屬相對豐度的占比在樣品間存在差異。

土壤AOA群落結構分析結果(圖4A)顯示，主成分1和主成分2分別解釋變量方差的49.83% 和29.09%；JX-7和JX-3在主成分軸1上有很好的分異，但是這兩個土壤中AOA群落在培養(yǎng)前后(0 d和50 d)沒有顯著分異。土壤AOB群落結構分析結果(圖4B)顯示，主成分1和主成分2分別解釋變量方差的89.55% 和9.13%；AOB群落在JX-3和JX-7間沒有分異，但這兩個土壤AOB群落在培養(yǎng)前后(0 d和50 d)表現(xiàn)出很好的分異。

2.4 優(yōu)勢OTUs的絕對豐度

土壤AOA絕對豐度前20位OTUs分析結果(表2)顯示，JX-7中otu1138和otu563絕對豐度在培養(yǎng)后顯著增加，而JX-3中沒有顯著變化的OTUs。土壤AOB絕對豐度前20位OTUs分析結果(表3)顯示，JX-3中otu1618、otu487、otu2315、otu1460、otu1552、otu847、otu830和otu388絕對豐度在培養(yǎng)前后(0 d和50 d)存在顯著變化；JX- 7土壤中otu1618絕對豐度在培養(yǎng)前后(0 d和50 d)存在顯著變化。

表2 土壤AOA前20位OTUs的絕對豐度(103 copies/g干土)

注：None表示該OTU在NCBI數(shù)據(jù)庫中沒有比對結果；黑體字的數(shù)值表明該OTU絕對豐度在培養(yǎng)時間(0 d和50 d)間存在顯著差異(<0.05)，下表同。

表3 土壤AOB前20位OTUs的絕對豐度(103 copies/g干土)

續(xù)表3

3 討論與結論

氨氧化微生物調(diào)控的硝化作用是土壤酸化加速的主要驅動者，且硝化速率越快，土壤pH下降越多[21]。本研究中JX-7土壤硝化速率高于JX-3，相應的土壤pH下降越多(圖1)。有學者對我國酸性土壤中AOA和AOB群落與土壤硝化潛勢相關性進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)氨氧化過程主要由AOA驅動[11-22]。但也有大量關于AOB主導酸性土壤硝化作用的報道[13-15]。而本研究通過分析氨氧化微生物豐度特征，發(fā)現(xiàn)所研究的酸性土壤硝化作用由AOA主導發(fā)生(圖2和圖4)。雖然兩個土壤AOA和AOB豐度在培養(yǎng)前后都有所變化，但AOA的變化更符合與硝化速率的關系。明顯的，JX-3土壤經(jīng)過50 d的培養(yǎng)后，其硝化作用很弱，AOA豐度沒有顯著變化，但AOB豐度顯著增加。推測供試土壤只是提供了AOB生長的環(huán)境，但并沒有刺激其硝化能力[22]。類似的，He等[23]報道，施加肥料后酸性土壤AOB豐度增加，但AOB并不是硝化作用的主要驅動者。這可能是由于土壤pH是影響AOB發(fā)揮硝化能力的一個主要因素[23-24]。

Gubry-Rangin等[24]研究結果表明，AOA群落結構改變與酸性土壤硝化作用的發(fā)生密切相關。然而本研究結果顯示，兩個土壤AOA群落組成在培養(yǎng)前后沒有顯著分異(圖4A)，暗示AOA不是主要通過改變其整體群落結構來參與硝化作用。而某些AOA的OTUs絕對豐度在培養(yǎng)前后有顯著增加(表2)，說明AOA發(fā)揮其氨氧化功能主要是通過個別微生物。有學者研究表明，AOA群落中和與酸性土壤硝化作用密切相關，且與土壤pH和底物NH3濃度有關[12, 25-27]。He等[23]和Leininger等[27]研究發(fā)現(xiàn)，泉古菌是提高酸性土壤硝化作用的關鍵氨氧化微生物。本研究中，JX-7土壤AOA中otu1138和otu563絕對豐度的顯著增加說明，供試土壤AOA中屬的一些個別微生物種類主要參與土壤硝化過程。

前期研究中，所有可培養(yǎng)的最適生長pH均為中性(pH 6.0 ~ 8.0)[28-29]。分子學研究表明，在中性和堿性土壤AOA中是優(yōu)勢屬[20, 30-31]。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤氨氧化作用與密切相關[32-33]。Lin等[14]和Zhang等[32]分別對酸性土壤氨氧化微生物豐度進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)AOA的絕大部分序列屬于。Wang等[33]利用穩(wěn)定同位素核酸標記探針技術，研究表明是酸性土壤上發(fā)揮氨氧化功能的主要AOA類群，且其在酸性環(huán)境中是化能自養(yǎng)型微生物。這可能是由于AOA含有編碼酸堿平衡的基因[34]以及AOA對底物的親和力高于AOB[33]；或者可能是由于該菌屬微生物在適應酸性環(huán)境過程中具備了某種代謝能力以緩解低pH對其毒害作用[34-35]。同時，這些結果也說明了酸性土壤上氨氧化過程的復雜性，需要我們進一步闡明。

本研究對初始pH相近的兩個酸性土壤中硝化作用及氨氧化微生物的豐度特征和群落結構的研究結果表明，AOA應該在所研究的酸性土壤硝化作用中扮演著關鍵角色，AOA調(diào)控硝化功能的實現(xiàn)主要是通過增加個別微生物物種的豐度而不是改變整個群落組成。

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May Be A Major Driver of Nitrification in Acidic Soils

LI Wenxing1,2, ZHENG Manman1,2, WANG Chao1*, SHEN Renfang1,2

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study, samples of two acidic soils (JX-3 and JX-7) with similar initial pH ??were selected for incubation experiments to study the roles of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB) in the nitrification of acidic soils. The results showed that after 50 d incubation, the nitrification rate of JX-7 sample was significantly higher than that of JX-3, and soil pH was significantly reduced. After incubation, AOB abundances of two soil samples increased, but there was no significant difference between two soil samples; AOA abundance of JX-7 significantly increased, while JX-3 changed insignificantly. AOA community structures of two soil samples were different, but there was no significant difference between incubation time; AOB community structures of two soil samples had the similar community structure, but they were different between incubation time. After incubation, the absolute abundances of dominant AOA (e.g.,and some unknown microbes) in JX-7 sample significantly increased; the absolute abundances of some AOB such asin both two samples significantly increased. Therefore, AOA played an important role in nitrification of acidic soil studied; and AOA mainly regulated nitrification by increasing the abundances of individual OTUs such asrather than the entire community.

; Ammonia-oxidizing archaea; Absolute abundance; Nitrification rate; Acidic soils

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.003

李文興, 鄭曼曼, 王超, 等. 亞硝化球菌屬()可能是酸性土壤硝化作用的重要驅動者. 土壤, 2021, 53(1): 13–20.

國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFC0407604，2016YFD0200302)和國家自然科學基金項目(51779077，91747104)資助。

(chwang@issas.ac.cn)

李文興 (1993—)，女，山西大同人，碩士研究生，主要從事土壤氮循環(huán)微生物研究。E-mail: liwenxing@issas.ac.cn