分子標(biāo)記輔助選擇改良黃華占和五山絲苗的褐飛虱抗性

毛方明,王紅波,牟同敏

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳改良國家重點實驗室,湖北 武漢 430070;2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江西省超級水稻研究發(fā)展中心,江西 南昌 330200;3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所,湖北 武漢 430064)

褐飛虱是水稻上危害性最強的單食性害蟲,具有極強的繁殖能力,主要危害亞洲栽培稻和野生稻。在2006～2015年的10年中,我國每年因稻飛虱造成的水稻產(chǎn)量損失可達到11.9億kg,占水稻五大病蟲害損失總量的29.51%[1]。褐飛虱的頻繁暴發(fā)不僅對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響,還因為殺蟲劑的過量使用增加了水稻生產(chǎn)成本,破壞了自然生態(tài)系統(tǒng)平衡。多年實踐證明,利用褐飛虱抗性基因培育抗褐飛虱水稻新品種,是最經(jīng)濟、環(huán)保且符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的褐飛虱防治手段。

到目前為止已至少鑒定到34個主效的褐飛虱抗性基因位點[2-3]。除此之外,還有約100個褐飛虱抗性相關(guān)QTLs被報道。Bph3、Bph6、Bph9、Bph14、BPH18、Bph26、bph29和Bph32等8個抗性基因已經(jīng)被克隆[3-6]。位于第3號染色體長臂端的Bph14基因是首個通過圖位克隆技術(shù)獲得的褐飛虱抗性主效基因[4]。Bph14基因可以使水稻葉鞘中產(chǎn)生大量胼胝質(zhì),保持篩管堵塞,同時還能促進胰蛋白酶抑制劑合成來達到抑制褐飛虱取食的目的[7]。Bph15位于第4號染色體著絲粒臨近區(qū)域的重組冷點區(qū)約580 kb區(qū)間內(nèi),雖然該基因還未被克隆,但實踐顯示該基因具有較好的抗褐飛虱效果,已被廣泛應(yīng)用于水稻褐飛虱抗性育種中[8]。

利用MAS技術(shù)可快速進行優(yōu)良基因滲入及多基因聚合。實踐證明,利用MAS聚合褐飛虱抗性基因可以有效提高水稻的褐飛虱抗性。Wang等利用MAS將Bph6和Bph9基因聚合于93-11背景中,成功選育出農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)與93-11相似的雙基因聚合系珞揚69,其褐飛虱抗性顯著高于Bph6和Bph9的單基因?qū)胂?并且由珞揚69組配的攜帶Bph6和Bph9雜合基因的雜交組合也表現(xiàn)出較高的褐飛虱抗性[9]。李進波等通過9311和1826水稻品種創(chuàng)建了Bph14和Bph15基因的單基因和雙基因?qū)胂?褐飛虱抗性鑒定顯示其雙基因?qū)胂稻_到高抗水平,Bph14、Bph15單基因?qū)胂捣謩e表現(xiàn)出中抗以上和抗或高抗水平,說明雙基因的效果強于單基因[10]。

本研究分別以常規(guī)秈稻‘黃華占’和‘五山絲苗’為母本,與攜帶褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的供體材料‘HB13001-14-5’(簡稱HB1-14-5)進行雜交和連續(xù)回交,結(jié)合分子標(biāo)記檢測技術(shù)和田間表型選擇,最終選育出2個褐飛虱抗性明顯提高、其他性狀綜合表現(xiàn)與輪回親本‘黃華占’相似的新株系‘HB6-8’和‘HB7-40’,以及2個褐飛虱抗性明顯提高、其他性狀綜合表現(xiàn)與‘五山絲苗’相似的新株系‘HB1-44’和‘HB7-50’。

1 材料與方法

1.1 供試材料和分子標(biāo)記

受體親本‘黃華占’和‘五山絲苗’是廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)常規(guī)水稻新品種。本研究的‘黃華占’和‘五山絲苗’種子分別由湖北省種子集團有限公司和安徽荃銀種業(yè)有限公司提供。供體親本‘HB1-14-5’是本實驗室從‘新6134/B5’后代選育的攜帶Bph14和Bph15基因的中間材料,抗褐飛虱。

本研究用于檢測Bph14基因的緊密連鎖的Indel標(biāo)記為76-2,正反序列分別為5’-CTGCTGCTGCTCTCGTATTG-3’和5’-CAGGGAAGCTCCAAGAACAG-3’[4]。用于檢測Bph15基因的Indel標(biāo)記為InD4,正反序列分別為5’-AGAATGCTAAAGATGACTGAA-3’和5’-AACGGTATTGTTCTTGTCTAA-3’[8]。DNA的提取參照CTAB微量法；PCR擴增程序參考Du等的分子檢測實驗方法[4]。

1.2 苗期褐飛虱抗性的鑒定方法

本試驗在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)褐飛虱鑒定網(wǎng)室進行。每個待鑒定的材料各3次重復(fù),B5和TN1分別作為抗蟲對照和感蟲對照。具體操作方法和評價標(biāo)準(zhǔn)參考國際標(biāo)準(zhǔn)苗期集團篩選法[11]。

1.3 產(chǎn)量、主要性狀和稻米品質(zhì)的測定方法

于2018年夏季,在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鄂州水稻育種基地進行產(chǎn)量比較試驗,每個材料每個重復(fù)種植200株,行距是20 cm，株距是16.7 cm；每個材料3次重復(fù),隨機區(qū)組設(shè)計，四周種植保護行。在移栽后統(tǒng)一進行正常的田間管理。在生育期間記載生育期。在成熟時,每小區(qū)取樣5株，進行株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等主要性狀的考查。分小區(qū)收獲,在揚凈、曬干(含水量13%)后,測定產(chǎn)量。稻米品質(zhì)分析參照徐鵬等的方法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良株系的創(chuàng)建過程

于2014年夏季,在武漢種植受體親本‘黃華占’、‘五山絲苗’和供體親本‘HB1-14-5’,并分別進行雜交。在同年冬季,在海南種植2個雜交組合的F1各20株；在苗期，利用與Bph14、Bph15基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對全部單株進行分子檢測；在抽穗期,選擇兩個目標(biāo)基因均雜合的單株(即真雜種),分別與對應(yīng)的輪回親本回交,分別收獲BC1F1種子；從BC1F1至BC3F1,每個世代都進行分子標(biāo)記檢測，篩選同時攜帶兩個抗性基因的單株,并選擇表型與輪回親本最相似的單株與對應(yīng)的輪回親本進行回交。于2016年5月,在武漢分別種植具有‘黃華占’和‘五山絲苗’遺傳背景的BC3F1世代,選擇其中同時攜帶雜合Bph14、Bph15基因,表型與對應(yīng)輪回親本最相似的單株,收獲BC3F2種子；在BC3F2世代,從880株的‘黃華占’/‘HB1-14-5’群體中篩選獲得攜帶純合Bph14和Bph15基因的單株39個,從720株‘五山絲苗’/‘HB1-14-5’群體中篩選獲得攜帶純合Bph14和Bph15基因的單株28個,分別收獲自交種子;從BC3F3到BC3F5世代,每個世代繼續(xù)利用分子標(biāo)記對目標(biāo)基因進行檢測,并跟蹤選擇,同時對中選株系的苗期褐飛虱抗性進行鑒定；對BC3F5株系進行3次重復(fù)的產(chǎn)量比較試驗,分析主要性狀及稻米品質(zhì)。在2018年秋季,決選出2個攜帶純合Bph14和Bph15基因,主要性狀及稻米品質(zhì)與‘黃華占’相似的新株系,分別命名為HB6-8和HB7-40;同時決選出2個攜帶純合Bph14和Bph15基因,主要性狀及稻米品質(zhì)與‘五山絲苗’相似的新株系,分別命名為HB1-44和HB7-50。改良株系的創(chuàng)建過程以及新株系抗性基因的分子檢測結(jié)果分別見圖1和圖2。

陰性對照為‘黃華占’和‘五山絲苗’;陽性對照為HB1-14-5;每個株系含5個泳道,76-2和InD4分別檢測Bph14和Bph15基因。

2.2 改良株系的遺傳背景回復(fù)率分析

將4個決選株系的種子進行催芽,從中隨機選取30粒種子的幼芽進行混合取樣。樣品送至中國種子集團公司生命科學(xué)中心,使用水稻育種芯片RICE6K進行遺傳背景分析。RICE6K芯片共包含5102個均勻覆蓋水稻12條染色體的SNP和InDel標(biāo)記,其中SNP的分布密度為每1 Mb 12個SNPs[13]。親本間差異分析結(jié)果表明：在‘黃華占’與‘HB1-14-5’之間有678個SNP標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性；而在‘五山絲苗’與‘HB1-14-5’之間有689個SNP標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性。在改良株系中,來源于供體‘HB1-14-5’的染色體片段主要集中在抗性基因Bph14和Bph15的上下游區(qū)段(圖3)；除此之外,在其余染色體上也有少量供體來源的片段分布；株系HB6-8、HB7-40、HB1-44和HB7-50的遺傳背景回復(fù)率分別為94.52%、90.91%、94.57%和92.69%。

BB表示來源于供體親本的染色體片段;AB表示雜合的染色體片段;AA表示來源于受體親本的染色體片段。

2.3 改良株系在苗期的褐飛虱抗性表現(xiàn)

于2018年7月,在武漢對改良株系的苗期褐飛虱抗性進行了鑒定。以TN1作為感蟲對照,以攜帶Bph14和Bph15基因的B5作為抗蟲對照,每份材料3次重復(fù)。抗性鑒定結(jié)果表明：受體親本‘黃華占’和‘五山絲苗’以及感蟲對照TN1的平均受害等級分別為7.0、8.3和8.3級,表現(xiàn)為感或高感褐飛虱；供體親本‘HB1-14-5’和抗蟲對照B5的平均受害等級分別為3.0和1.7級,分別表現(xiàn)為抗和高抗褐飛虱；4個改良株系的平均受害等級為1.0～2.3級,表現(xiàn)為抗或高抗褐飛虱,其中具有‘黃華占’背景的兩個改良株系HB6-8和HB7-40的平均受害等級均為2.3級,表現(xiàn)為抗褐飛虱;具有‘五山絲苗’背景的兩個改良株系HB1-44和HB7-50的平均受害等級分別為1.7和1.0級,均表現(xiàn)為高抗褐飛虱(圖4a和圖4b)。

2.4 改良株系的產(chǎn)量、主要性狀及稻米品質(zhì)表現(xiàn)

改良株系的產(chǎn)量比較試驗和主要性狀考察結(jié)果(表1)表明：株系HB6-8和HB7-40的株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗總粒數(shù)、產(chǎn)量與受體親本‘黃華占’沒有顯著差異,但是播始歷期比‘黃華占’縮短了2～3 d,在高溫條件下結(jié)實率和千粒重比黃華占提高;HB1-44的播始歷期、單株有效穗數(shù)、穗長、結(jié)實率和產(chǎn)量都與受體親本‘五山絲苗’沒有顯著差異,但是株高和千粒重顯著提高,每穗總粒數(shù)極顯著降低；株系HB7-50除播始歷期和每穗總粒數(shù)極顯著低于‘五山絲苗’外,產(chǎn)量、其他性狀與五山絲苗無顯著性差異。

稻米品質(zhì)分析結(jié)果(表2)表明,在分析的10項理化指標(biāo)中,改良株系HB6-8和HB7-40與‘黃華占’基本相似，而HB1-44和HB7-50與‘五山絲苗’基本相似。

3 討論

3.1 分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)有助于快速改良水稻的抗性

分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)技術(shù)結(jié)合常規(guī)育種是目前進行作物育種改良的有效途徑,其準(zhǔn)確率和選擇效率高,育種周期短。本研究采用該方法將Bph14 和Bph15基因滲入優(yōu)良常規(guī)稻‘黃華占’和‘五山絲苗’背景中,分別獲得了2個褐飛虱抗性顯著提高,且產(chǎn)量、主要性狀和稻米品質(zhì)與受體親本相似的新株系,可以作為黃華占和五山絲苗的抗褐飛虱替代品系進一步進行多點試驗和區(qū)域試驗。

a:褐飛虱取食后幼苗的表現(xiàn)。b:幼苗的抗性分?jǐn)?shù)及抗性水平。B5:抗蟲對照。TN1:感蟲對照。S、HS、R和HR分別表示感、高感、抗和高抗褐飛虱。

表1 改良株系2018年在鄂州的產(chǎn)量和主要性狀表現(xiàn)

表2 改良株系2018年在鄂州的稻米品質(zhì)分析結(jié)果

作物的抗蟲、抗病等抗性基因主要受主效基因的控制,受外界環(huán)境因素的影響較小。通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將這些抗性基因?qū)肽繕?biāo)品種,以改良其抗性是一種十分有效的途徑。例如,任西明等利用Bph14和Bph15基因,通過MAS成功改良了兩系不育系C815S的褐飛虱抗性[14];徐鵬等通過MAS將Pi9、Xa23、Bph14 和Bph15基因聚合于水稻恢復(fù)系R1813中,獲得了稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性均明顯提高的新株系[12]。

利用MAS技術(shù)除了可以進行前景(目標(biāo)基因)選擇外,還可以對遺傳背景進行選擇。隨著分子標(biāo)記的普及和不斷開發(fā),SSR、RFLP、AFLP、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)科研的各個領(lǐng)域。前期利用分子標(biāo)記進行遺傳背景選擇時,可以快速淘汰一些不符合育種要求的單株；對于背景回復(fù)率高的單株,則需要繼續(xù)在未恢復(fù)為輪回親本的位點附近繼續(xù)增加標(biāo)記進行回交選擇,以此縮小與輪回親本間的差異。MAS雖然能夠給作物育種和改良提供便利,但在應(yīng)用過程中也暴露出一些缺點,比如MAS只能從構(gòu)成表型的所有變異中捕獲主效基因帶來的變異,而非主效基因累加的變異被忽視。為了達到更加精確的育種目標(biāo),可以利用全基因組選擇方法,在基因組水平上對與目標(biāo)性狀相關(guān)的所有QTL進行檢測,從而捕獲主效和非主效基因帶來的變異。

3.2 褐飛虱抗性基因Bph14和Bph15的利用價值及策略

Bph14和Bph15基因是目前褐飛虱抗性基因研究中使用較為廣泛的兩個主效基因,前人研究均表明其具有良好的褐飛虱抗性。本研究利用MAS將Bph14和Bph15基因分別聚合在常規(guī)稻‘黃華占’及‘五山絲苗’中,獲得的4個新株系的褐飛虱抗性均達抗級水平以上,表明純合Bph14和Bph15基因聚合能夠達到抗褐飛虱的效果。Hu等的研究表明，Bph14和Bph15在‘明恢63’背景中表現(xiàn)出較高的褐飛虱抗性,在其所配的雜交組合中,Bph14和Bph15在單基因雜合、單基因純合、雙基因雜合、雙基因純合狀態(tài)下均表現(xiàn)出一定的褐飛虱抗性,且抗性逐漸增強[16]。Wang等的研究結(jié)果表明,攜帶純合Bph14和Bph15的親本或雜交組合在苗期均具有優(yōu)良的褐飛虱抗性,而攜帶雜合Bph14和Bph15基因的雜交組合在苗期均表現(xiàn)為感褐飛虱[17]。上述研究結(jié)果表明純合Bph14和Bph15基因在不同遺傳背景中均能表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性,而雜合Bph14和Bph15基因在不同遺傳背景下其抗性可能有差異,表明Bph14和Bph15基因具有劑量效應(yīng),是不完全顯性表達的。因此,若利用Bph14和Bph15基因進行抗蟲雜交稻選育,最好選擇攜帶相同褐飛虱抗性基因的不育系和恢復(fù)系進行配組,使雜交稻攜帶純合的褐飛虱抗性基因,從而達到最佳的抗褐飛虱效果。