姚鵬強(qiáng) 袁軼 程世平

摘要：為解決張良姜繁殖系數(shù)低、容易感染病菌的問(wèn)題，進(jìn)一步加快張良姜育種進(jìn)程，以河南省魯山縣張良鎮(zhèn)種姜為材料，首先建立張良姜莖尖離體培養(yǎng)再生體系，進(jìn)一步利用秋水仙堿對(duì)其體細(xì)胞染色體進(jìn)行誘導(dǎo)加倍。結(jié)果表明，張良姜莖尖不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 01 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.33%。不定芽生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，生根率可達(dá)86.67%。張良姜同源四倍體誘導(dǎo)最佳處理組合為100 mg/L秋水仙堿浸泡莖尖72 h再接種培養(yǎng)，四倍體最高誘導(dǎo)率為8.89%。對(duì)照組張良姜為二倍體（2n=2x=22），誘導(dǎo)獲得的四倍體張良姜染色體為2n=4x=44。共獲得7個(gè)四倍體植株，繼代培養(yǎng)3次后倍性保持穩(wěn)定，可為張良姜良種選育提供良好的原始材料。

關(guān)鍵詞：張良姜;離體培養(yǎng);染色體加倍;同源四倍體

中圖分類號(hào)：S632.503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）02-0104-04

收稿日期：2020-05-19

基金項(xiàng)目：平頂山學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：BXY-BSQD-2018031、PXY-BSQD2016009）;河南省科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：182102110132、172102110111、）。

作者簡(jiǎn)介：姚鵬強(qiáng)（1986—），男，云南曲靖人，博士，講師，主要研究方向?yàn)橹参锒啾扼w遺傳育種。E-mail：yaopengqiang1988@163.com。

張良姜為姜科姜屬多年生草本植物[1-4]，原產(chǎn)于河南省魯山縣張良鎮(zhèn)，距今已有2 200多年的種植歷史。2010年5月，張良姜被授予國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)，是全國(guó)首個(gè)獲得農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記保護(hù)的生姜產(chǎn)品，享有姜中之王的美譽(yù)[5]，其色澤金黃、久煮不爛、辛辣芳香[6]，是集調(diào)味品、食品加工原料、藥用于一體的多用途經(jīng)濟(jì)作物[7-9]。

長(zhǎng)期以來(lái)，張良姜主要利用地下塊根進(jìn)行無(wú)性繁殖，伴隨一些病毒病菌經(jīng)常導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，并且長(zhǎng)期無(wú)性繁殖會(huì)造成種性退化[10-11]。植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)是提高姜產(chǎn)量和品質(zhì)最為有效的方法之一[12-14]。因此，有必要通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)現(xiàn)有優(yōu)良張良姜進(jìn)行脫毒和復(fù)壯，提高品種自身抗逆性和增產(chǎn)潛力。

目前，張良姜育種還處于起步階段，其雌雄花敗育，常規(guī)雜交育種難以發(fā)揮作用。然而，在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用體細(xì)胞染色體加倍技術(shù)來(lái)獲取多倍體具有巨大的育種價(jià)值。許多研究表明，多倍體植物在育種方面具有生活能力強(qiáng)以及抗病蟲害等特點(diǎn)[15-18]。本研究以張良姜幼嫩芽為外植體，首先建立其離體培養(yǎng)再生體系，之后通過(guò)秋水仙堿誘導(dǎo)其體細(xì)胞染色體加倍，獲得張良姜同源四倍體。此研究旨在推動(dòng)張良姜產(chǎn)業(yè)發(fā)展，以期培育張良姜新品種。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選擇健壯、無(wú)病的張良種姜為材料。試驗(yàn)在河南省平頂山學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院低山丘陵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于2017年4月至2019年5月份進(jìn)行。

1.2初代培養(yǎng)基配制

初代培養(yǎng)基配制以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基嘌呤），具體激素組合見(jiàn)表1，處理編號(hào)依次記為M1～M4。所配制的4個(gè)培養(yǎng)基配方處理中蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為0.75%，pH值范圍為5.6～5.8。每個(gè)培養(yǎng)基配制30瓶。

1.3外植體消毒與接種

對(duì)張良姜種姜進(jìn)行催芽處理，將未發(fā)芽的姜塊放入鐵托盤，噴灑適量水，蓋上塑料膜，25 ℃下培養(yǎng)催芽。待芽長(zhǎng)出1 cm左右，用手術(shù)刀切取幼芽，首先用70%乙醇處理1 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞消毒12～15 min，無(wú)菌水沖洗3次，去除幼芽外層2～3層幼葉，將莖尖接種于培養(yǎng)基，每瓶接種1個(gè)外植體。放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1） ℃，光照度為2 000～3 000 lx，培養(yǎng) 30 d 后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織及不定芽數(shù)量。

1.4生根培養(yǎng)

選取2～3 cm生長(zhǎng)狀態(tài)相同的單個(gè)叢生芽，分別接種于添加不同濃度6-BA（0.5、1.0 mg/L）或NAA（0.5、1.0 mg/L）以及不添加激素的9種生根培養(yǎng)基（K0～K8）中進(jìn)行生根培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。每個(gè)培養(yǎng)基接種1個(gè)芽，每種培養(yǎng)基接種15個(gè)叢生芽，重復(fù)3次。

1.5秋水仙堿誘導(dǎo)張良姜體細(xì)胞染色體加倍

分別配制濃度為50、100、150、200 mg/L的秋水仙堿溶液，用無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。選取健壯的組培苗，將其頂芽及帶有側(cè)芽的莖段切下，分別放入不同濃度的秋水仙堿溶液中。黑暗環(huán)境下，在振蕩培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。之后用無(wú)菌水沖洗材料4～5次，用無(wú)菌濾紙將材料表面水分吸干，將材料接種到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每個(gè)處理組合重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)分5瓶，每瓶接種3個(gè)材料。20 d 后統(tǒng)計(jì)外植體存活率。

1.6倍性鑒定

取第3次繼代培養(yǎng)的幼苗嫩葉，利用流式細(xì)胞儀（sysmex partec GmbH）進(jìn)行檢測(cè)，取幼嫩葉片約 1 cm2 大小放入一次性塑料皿中，加入200 μL細(xì)胞裂解液[希森美康生物科技（無(wú)錫）有限公司]，然后用鋒利的刀片迅速將其切碎，30 μm孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾，加入800 μL DAPI染色液[希森美康生物科技（無(wú)錫）有限公司]，以二倍體材料為內(nèi)參進(jìn)行倍性檢測(cè)。

之后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的植株進(jìn)行染色體壓片計(jì)數(shù)進(jìn)一步確定倍性水平。以張良姜組培苗幼嫩根尖為材料。飽和對(duì)二氯苯中預(yù)處理3 h，經(jīng)蒸餾水沖洗后，置于卡諾固定液（V無(wú)水乙醇 ∶V冰醋酸= 3 ∶1），4 ℃固定24 h。之后，將材料轉(zhuǎn)移到1 mol/L鹽酸溶液中酸解10～15 min，蒸餾水沖洗并浸泡 10 min。取少量材料置于載玻片上，滴加卡寶品紅染色液染色5 min，蓋上蓋玻片，壓片，置于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1初代培養(yǎng)基的篩選

不同初代培養(yǎng)基誘導(dǎo)張良姜不定芽效果如表2所示，在NAA濃度相同的情況下，添加不同濃度的6-BA進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，其中，以M3組合最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)83.3%，即張良姜莖尖再生較適合培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)張良姜生根的影響

由表3可以看出，在生根培養(yǎng)基中，生根效果最差的培養(yǎng)基為K0，即不添加植物激素的MS/2培養(yǎng)基，在添加NAA或IBA之后，各個(gè)處理的生根率都有不同程度的提高?？傮w來(lái)看，NAA和IBA 2種激素在誘導(dǎo)生根效果方面存在一定差異。在相同濃度下，添加NAA比 IBA的生根效果更佳。其中，NAA的濃度為0.5 mg/L最適合叢生芽生根，生根率可達(dá)86.67%。因此，MS/2+NAA 0.5 mg/L為誘導(dǎo)張良姜叢生芽生根的最適培養(yǎng)基。

2.3張良姜同源四倍體誘導(dǎo)

對(duì)誘導(dǎo)獲得的張良姜植株進(jìn)行倍性鑒定。四倍體張良姜的峰值在橫坐標(biāo)上是內(nèi)參二倍體的2倍（圖1-a）。染色體壓片計(jì)數(shù)結(jié)果表明，未經(jīng)處理的二倍體張良姜染色體數(shù)為2n=2=22（圖1-b），誘導(dǎo)獲得的四倍體染色體數(shù)為2n=4x=44（圖1-c）。

不同濃度的秋水仙堿以及不同的處理時(shí)間對(duì)張良姜外植體存活率、不定芽的誘導(dǎo)率以及四倍體誘導(dǎo)率的影響結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，外植體的存活數(shù)隨著秋水仙堿濃度的增加以及處理時(shí)間的增加而降低，秋水仙堿濃度在50～200 mg/L范圍，持續(xù)處理時(shí)間在96 h內(nèi)，均有不定芽的產(chǎn)生。當(dāng)秋水仙堿濃度為100 mg/L、處理72 h時(shí)，誘導(dǎo)獲得張良姜同源四倍體4個(gè)，是本試驗(yàn)篩選的最優(yōu)處理組合。

3討論與結(jié)論

利用組培技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)張良姜脫毒種苗的快速繁殖。一些研究表明，NAA和6-BA的組合能夠更好地促進(jìn)生姜幼芽的分化和增殖[19-20]?？偟膩?lái)說(shuō)，培養(yǎng)基中植物激素的成分和濃度對(duì)張良姜快繁有顯著的影響。通過(guò)試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，在NAA濃度相同的情況下，當(dāng)添加的6-BA濃度由0.5 mg/L逐漸增加到2.0 mg/L時(shí)，不定芽的分化率增高，但當(dāng)6-BA濃度增加到3.0 mg/L時(shí)，不定芽的分化率開始下降，出現(xiàn)了一定的畸形芽。齊蘭等在研究海南小黃姜脫毒快繁技術(shù)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA的濃度高于3 mg/L時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致畸形苗及弱苗的增多[21]。由此認(rèn)為，當(dāng)6-BA的濃度為2.0 mg/L時(shí)，張良姜不定芽的誘導(dǎo)效果較好。

張良姜不定芽生根誘導(dǎo)，其最適宜培養(yǎng)基為 1/2 MS+NAA 0.5 mg/L，本試驗(yàn)中添加外源激素NAA和IBA均可誘導(dǎo)張良姜不定芽生根，其中添加NAA的效果好于添加IBA，與黃姜的根誘導(dǎo)情況[19]類似。在生姜的研究中，同時(shí)添加6-BA和NAA可以實(shí)現(xiàn)生姜增殖與生根誘導(dǎo)同步進(jìn)行，其中NAA對(duì)生根數(shù)和平均根長(zhǎng)有較大影響，6-BA對(duì)生姜生根數(shù)和長(zhǎng)度無(wú)顯著影響[11]。小黃姜的脫毒組培技術(shù)研究也表明，同時(shí)添加6-BA和NAA可使生根壯苗和繼代增殖同步完成[21-22]。而在本研究中，在所使用的初代培養(yǎng)基培養(yǎng)下，有部分不定芽有根的分化，生根率遠(yuǎn)低于加入NAA的生根培養(yǎng)基。因此，對(duì)于張良姜而言，將不定芽的誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)分別進(jìn)行效果更佳。

秋水仙堿是人工誘導(dǎo)植物多倍體最為常用的化學(xué)試劑之一，成功的關(guān)鍵在于秋水仙堿的處理濃度及處理時(shí)間[23-25]。在本研究中，以秋水仙堿濃度100 mg/L處理72 h效果最好，其次是150 mg/L處理72 h，較低的秋水仙堿濃度如50 mg/L并未獲得多倍體。而郭啟高等對(duì)生姜進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入30 mg/L秋水仙堿處理5 d可使生姜的誘變率達(dá)到65.0%[26]。說(shuō)明使用較低濃度秋水仙堿處理時(shí)須延長(zhǎng)處理時(shí)間方能發(fā)揮作用。另外，有效的藥劑濃度與誘導(dǎo)處理方式也有很大關(guān)系。利用秋水仙堿對(duì)姜芽進(jìn)行浸泡后再接種所使用的濃度通常比直接在培養(yǎng)基中加入進(jìn)行接種的濃度要高許多[26-27]，如曾楊等對(duì)脫毒生姜進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)研究表明，0.2%秋水仙堿浸泡生姜芽12 h的誘導(dǎo)率最高[28]。通過(guò)對(duì)張良姜頂芽及帶有側(cè)芽的莖段進(jìn)行秋水仙堿處理誘導(dǎo)獲得同源四倍體植株，可為張良姜良種的選育提供原始材料，為后續(xù)篩選優(yōu)良品系奠定基礎(chǔ)。

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