八味沉香散對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞SOD、MDA和凋亡影響的研究

徐 冰，角 加，聶 波

（1.中國(guó)藏學(xué)研究中心北京藏醫(yī)院 中醫(yī)科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部暨北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700）

缺血性心臟病對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害，在治療缺血性心臟病的過(guò)程中，缺血后再灌注反而使原缺血區(qū)組織損傷加重。研究心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的機(jī)制并尋求抗MIRI 有效藥物和方法尤為重要[1-2]。藏藥八味沉香散臨床觀察對(duì)冠心病心絞痛效果顯著，是治療心血管疾病常用藏藥之一。本研究以大鼠心肌細(xì)胞H9C2 為靶細(xì)胞，探討八味沉香散對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞中SOD 活性、MDA 水平以及細(xì)胞凋亡的影響，研究其保護(hù)心肌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 大鼠心肌細(xì)胞H9C2（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，貨號(hào)GNR 5）。

1.2 主要試劑 完全培養(yǎng)基（ECM）的配置：含10%特級(jí)胎牛血清（杭州四季青，貨號(hào)13011-8611），90%高糖DMEM（貨號(hào)12100）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（貨號(hào)T1300），PBS 磷酸鹽緩沖液（貨號(hào)P1010），細(xì)胞級(jí)DMSO（貨號(hào)8371），均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；有糖Earles 液（貨號(hào)CC0042），無(wú)糖Earles 液（貨號(hào)X0942），均購(gòu)自Leagene。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)A001-3）、細(xì)胞丙二醛（MDA）測(cè)試盒（貨號(hào)A003-4），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；八味沉香散（西藏神猴藥業(yè)）；曲美他嗪（HY-B0968），購(gòu)自MCE 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)P0012），細(xì)胞凋亡－Hoechst染色試劑盒（貨號(hào)C0003），均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus IMT-2）、徠卡倒置熒光顯微鏡（DM IL LED）、CO2培養(yǎng)箱（MCO-20AIC，SANYO 公司）、低氧CO2培養(yǎng)箱（MiniGalaxy A，RS biotech 公司）、超凈工作臺(tái)（ESCO公司）、臺(tái)式滅菌器（T4 0R3250）、純水機(jī)（GN-RO-40）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、低速離心機(jī)（LD4-2）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Clinic bio 128C）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 復(fù)制缺血再灌注體外模型 H9C2 細(xì)胞正常培養(yǎng)：將H9C2 細(xì)胞懸液以每平方厘米8 000 個(gè)接種至培養(yǎng)瓶中，CO2培養(yǎng)箱（95%空氣，5%CO2）中貼壁培養(yǎng)，第2 天更換ECM 以去除殘留的DMSO 和未貼壁的細(xì)胞，隔2 天換液1 次。至細(xì)胞大約90%融合時(shí)傳代，以PBS 漂洗2 遍，按40 μL/cm2加入0.25%胰酶消化液，約1 min 后鏡下觀察細(xì)胞變圓，震動(dòng)瓶壁至細(xì)胞脫落，按1:2 體積立即加入ECM 終止消化，收集細(xì)胞混懸液，1 000 rpm 離心5 min，棄液，將細(xì)胞團(tuán)重新混懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以104個(gè)/孔種入96 孔板正常培養(yǎng)，待細(xì)胞85%融合時(shí)造模。分組造模：以缺糖缺氧模擬缺血，復(fù)糖復(fù)氧模擬再灌注。設(shè)正常組、缺氧2 h、4 h、6 h 組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。正常組，缺氧時(shí)用有糖Earles 液，再灌時(shí)換ECM，始終在正常條件下培養(yǎng)。模型組，缺氧時(shí)用無(wú)糖Earles 液，低氧CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2，1%O2）中分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h，再用ECM 在CO2培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)24 h。造模結(jié)束以cck8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，每孔加CCK8 10 μL 和ECM 100 μL，37 ℃孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 各孔吸光度（OD）值。

1.4.2 八味沉香散提取物（水提）對(duì)心肌細(xì)胞SOD、MDA 水平的影響 將細(xì)胞以2.5×104/cm2接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞85%匯合時(shí)造模，方法同1.4.1。實(shí)驗(yàn)分組：正常組，有糖Earles 液培養(yǎng)4 h，更換ECM培養(yǎng)24 h，均在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；缺血再灌注組（I/R 組），低CO2培養(yǎng)箱中以無(wú)糖Earles 液培養(yǎng)4 h，更換ECM 于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；I/R ＋八味沉香散提取物（水提）高、中、低劑量組，在造模前1 h及I/R 時(shí)加入相應(yīng)濃度（240、120、60 ug/mL）的八味沉香散提取物；D.曲美他嗪對(duì)照組：在造模前1 h 及I/R 時(shí)加入240 ug/mL 的曲美他嗪。

造模結(jié)束后，胰酶消化收集細(xì)胞團(tuán)于ep 管中。1）細(xì)胞破碎：加1 mL PBS 混勻，1 000 r/min 離心10 min，留細(xì)胞沉淀，再加0.5 mL PBS，以冰水浴超聲破碎，每5 s 超1 次，間隔4 次，每次間隔30 s。2）蛋白濃度測(cè)定：加入按梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、等體積樣品于96孔板中，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)復(fù)孔，各孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃ 20 min，測(cè)定562 nm 的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算蛋白濃度。3）測(cè)定SOD 活力：設(shè)對(duì)照孔（20 μL 蒸餾水+20 μL酶工作液）、對(duì)照空白孔（20 μL 蒸餾水+20 μL 酶稀釋液）、測(cè)定孔（20 μL 樣本+20 μL 酶工作液）、測(cè)定空白孔（20 μL 樣本+20 μL 酶稀釋液），各孔均加入底物應(yīng)用液200 μL，混勻，37℃孵育20 min，測(cè)定A450 值。SOD 抑制率（%）=[（A對(duì)照-A對(duì)照空白）-（A測(cè)定-A測(cè)定空白）]/（A對(duì)照-A對(duì)照空白）×100%，SOD活力（U/mgprot）=SOD 抑制率/50%×（反應(yīng)體系/稀釋倍數(shù)）/待測(cè)樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。4）測(cè)定MDA 含量：造模結(jié)束后，于細(xì)胞團(tuán)加0.5 mL 提取液，冰水浴超聲破碎成懸液樣本。設(shè)空白管（無(wú)水乙醇）、標(biāo)準(zhǔn)管（10 nmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)品）、樣品管各取100 μL 均加入1 mL MDA 工作液，混勻，95℃水浴40 min，流水冷卻，4 000 r/min 離心10 min，取250 μL 反應(yīng)液加入96 孔板中，530 nm 測(cè)吸光度。MDA含量（nmol/mgprot）=（OD測(cè)定-OD空白）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）/樣本蛋白濃度（mgprot/mL）。

1.4.3 八味沉香散提取物（水提）對(duì)心肌凋亡的影響 取潔凈蓋玻片在75%乙醇中浸泡5 min，無(wú)菌PBS 洗滌3 遍，再用ECM 洗滌1 遍，將蓋玻片置于24 孔板內(nèi)，按2.5×104/cm2接種細(xì)胞，約為80%滿時(shí)造模。實(shí)驗(yàn)分組及造模方法同1.4.2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL 固定液，固定10 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。加0.5 mL Hoechst 33258 染色液，染色5 min，PBS 洗2 遍，每次3 min。滴1 滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 觀察照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 半定量結(jié)果用image J 軟件對(duì)圖象進(jìn)行灰度分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），最小顯著差法（LSD）進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H9C2 缺血再灌注損傷模型構(gòu)造 細(xì)胞形態(tài)特征變化：倒置顯微鏡下觀察正常組細(xì)胞呈多個(gè)小島樣克隆，胞體肥厚、透明，菱形或多角形，略長(zhǎng)，核小而圓，呈鋪路石樣，展開(kāi)貼壁，形態(tài)無(wú)明顯改變。體外模擬缺血，2 h 后模型組細(xì)胞稍有回縮，4 h 后模型組大量細(xì)胞回縮變瘦長(zhǎng)，間隙變大，部分漂浮，折光性增強(qiáng)，6 h 后模型組細(xì)胞大部分漂浮，細(xì)胞成膜狀脫落，細(xì)胞破裂，細(xì)胞膜完整性破壞。如圖1。缺血再灌注模型細(xì)胞增殖活性：不同時(shí)間缺氧再灌注對(duì)H9C2 細(xì)胞增殖活性O(shè)D 值，正常組（1.28±0.10），缺氧2 h 組（1.07±0.15），缺氧4 h 組（0.64±0.12），缺氧6 h組（0.37±0.38），可見(jiàn)體外模擬缺糖缺氧2 h、4 h、6 h 再灌注24 h 的各模型組體現(xiàn)細(xì)胞增殖活性的OD 值均低于正常組（P＜0.01）。說(shuō)明缺血2 h 時(shí)，細(xì)胞已出現(xiàn)損傷，隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，OD值下降，活細(xì)胞數(shù)減少，在6 h 細(xì)胞破損嚴(yán)重。故選取4 h 缺氧24 h 再灌注造模。

圖1 H9C2 不同時(shí)間缺血再灌注損傷模型（X100）

2.2 各組H9C2 細(xì)胞SOD 活力和MDA 濃度比較 見(jiàn)表1。

表1 各組H9C2細(xì)胞SOD活力和MDA濃度比較（，n=6）

表1 各組H9C2細(xì)胞SOD活力和MDA濃度比較（，n=6）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，# # P ＜0.01；與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.3 八味沉香散提取物（水提）對(duì)心肌凋亡影響 熒光鏡下觀察：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。Hoechst 33258 染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核顏色偏淡，細(xì)胞核體積較大，形狀較均一，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白，細(xì)胞核體積較小，形狀不均一，大小不等。正常組有極少量細(xì)胞核致密濃染，模型組有大量致密或碎塊狀的濃染細(xì)胞核，曲美他嗪組和八味沉香散各劑量組濃染細(xì)胞核較缺氧組明顯減少。見(jiàn)圖2。半定量圖像分析：模型組平均光密度明顯增高，與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01）。與模型組比較，曲美他嗪和八味沉香散的平均光密度顯著低于模型組（P＜0.01），表明八味沉香散能夠很好抑制MIRI 損傷造成的細(xì)胞凋亡，且藥效隨濃度升高增強(qiáng)。見(jiàn)表2。

圖2 各組H9C2 細(xì)胞凋亡熒光染色

表2 各組H9C2 細(xì)胞凋亡水平陽(yáng)性表達(dá)面積、光密度和平均光密度表（，n=6）

表2 各組H9C2 細(xì)胞凋亡水平陽(yáng)性表達(dá)面積、光密度和平均光密度表（，n=6）

注：與模型組比較，# # P ＜0.01；與正常組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3 討論

MIRI 導(dǎo)致大量活性氧自由基生成已被研究證實(shí)[3-4]?；钚匝踝杂苫碌难趸瘬p傷可以導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生，而抗氧化防御系統(tǒng)是保護(hù)機(jī)體免受損害的重要屏障[,5-6]。研究表明，正常機(jī)體內(nèi)的氧化/抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，過(guò)剩的活性氧自由基被機(jī)體正常的抗氧化防御系統(tǒng)清除；在受到MIRI 刺激后，線粒體電子傳遞鏈可以釋放出大量活性氧自由基，機(jī)體清除力不足，使氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài)被打破，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[7-8]?；钚匝踝杂苫梢耘c細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸和膽固醇結(jié)合，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物（MDA），使細(xì)胞膜流動(dòng)性下降而通透性增高，能間接反應(yīng)自由基對(duì)機(jī)體的損傷程度[9-10]。SOD 是體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的主要酶，除此外還有過(guò)氧化氫酶（GSHPx）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶、維生素C、維生素E 等，SOD 可以催化O2-歧化反應(yīng)，生成氧化活性相對(duì)較弱的H2O2，并繼續(xù)在過(guò)氧化氫酶和GSHPx 的催化下轉(zhuǎn)化成水，其水平的高低可反映機(jī)體清除自由基的能力[11-12]；兩者常共同檢測(cè)以評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力/氧化損傷程度[13]?；钚匝踝杂苫T發(fā)細(xì)胞凋亡的途徑主要有2 種：1）直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使蛋白質(zhì)肽鍵斷裂，受體蛋白酶、通道蛋白等膜蛋白分布紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]；產(chǎn)生的脂質(zhì)過(guò)氧化物和OH 也能直接損傷DNA，影響DNA 的穩(wěn)定，使DNA 斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16]；2）間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。活性氧通過(guò)影響線粒體呼吸鏈、細(xì)胞內(nèi)的鈣離子等，影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。

本研究中，缺氧再灌注損傷后大鼠心肌細(xì)胞的MDA 濃度明顯升高，SOD 活力降低，而八味沉香散提取物（水提）能有效抑制MIRI 造成的MDA 濃度升高，使SOD 活力保持在較高水平，減輕細(xì)胞的氧化損傷。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，缺氧再灌注損傷使心肌細(xì)胞的凋亡水平明顯增加，八味沉香散提取物（水提）能夠明顯抑制MIRI 造成的細(xì)胞凋亡。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)八味沉香散的抗缺氧再灌注損傷作用，是通過(guò)減少應(yīng)激狀態(tài)下活性氧化自由基的形成，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物生成，提高抗氧化能力如SOD 活力，阻斷由其誘發(fā)的細(xì)胞凋亡的直接和間接途徑，達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞作用的。

藏藥八味沉香散記載于《四部醫(yī)典》中，由沉香、肉豆蔻、廣棗、石灰華、木棉花、乳香、木香和訶子等8 味藏藥組成，具有養(yǎng)心安神、理氣開(kāi)竅、行氣活血等功效。本研究顯示，八味沉香散能夠通過(guò)提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力，減少缺血再灌注損傷氧化物的生成，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞，為藏醫(yī)獨(dú)特組方理論、藏藥高抗缺氧作用提供了切實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有廣闊的應(yīng)用前景和社會(huì)價(jià)值。