1例成骨不全患者致病基因鑒定

趙 強(qiáng)，黃泳華，馮穗華，冼詩(shī)瑤，潘焯儀，吳欣新，張妙蓮，吳海濤（廣東省江門(mén)市中心醫(yī)院，廣東江門(mén) 529000）

成骨不全(OI)是一種以骨量降低、骨骼脆性增加、反復(fù)骨折及藍(lán)鞏膜為主要特征的單基因遺傳病，在新生兒中發(fā)生率約為1/20000[1-2]。成骨不全臨床表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性都非常強(qiáng)，臨床表型譜非常豐富，不同患者臨床表現(xiàn)差異非常大，可以僅表現(xiàn)為骨密度稍低，也可有嚴(yán)重骨骼異常，甚至出現(xiàn)嬰兒期致死[3-4]。1979年Sillence根據(jù)臨床表現(xiàn)和遺傳方式將其分為 4種亞型[5]，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，成骨不全相關(guān)致病基因被陸續(xù)鑒定發(fā)現(xiàn)[6]，目前按致病基因分類(lèi)已達(dá)十余種。通過(guò)檢索OMIM及 Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)可發(fā)現(xiàn)，目前已報(bào)道與成骨不全臨床表現(xiàn)明確相關(guān)基因已有 10余個(gè)，其中大多數(shù)已報(bào)道病例均是由常染色體顯性基因COL1A1和COL1A2所引起[7]，COL1A1和COL1A2為Ⅰ型膠原蛋白編碼基因。近年來(lái)不斷有報(bào)道由常染色體隱性基因突變所導(dǎo)致的成骨不全病例[8]，這些基因可調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾、分泌及加工[2]。由于各亞型在臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特征上的重疊，成骨不全的臨床診斷及分類(lèi)一直都比較困難[9]。隨著近年高通量基因測(cè)序技術(shù)在臨床診斷上廣泛應(yīng)用，尤其適應(yīng)于成骨不全這類(lèi)臨床表現(xiàn)度及遺傳異質(zhì)性均較復(fù)雜的疾病分子診斷。在本研究中，我們對(duì)1 例疑似成骨不全的家系使用相關(guān)基因捕獲測(cè)序方法，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)過(guò)濾、篩選及分析，鑒定該成骨不全家系致病性基因突變，并對(duì)基因突變進(jìn)行家系遺傳機(jī)制分析及相關(guān)功能學(xué)預(yù)測(cè)研究，以期為其臨床診斷、預(yù)防及后續(xù)生育阻斷提供有效的分子診斷信息。

1 病例資料

1.1 研究對(duì)象

患兒為 10歲女孩，自4 歲起反復(fù)骨折，查體及X線檢查顯示雙下肢及前臂彎曲畸形，胸骨畸形，雙下肢及肱骨多處骨折(圖 1)，無(wú)明顯壓痛，伴有牙發(fā)育不良，藍(lán)色鞏膜(圖 2)，聽(tīng)力正常。臨床診斷為疑似成骨不全，但一直未進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)。患兒父母均無(wú)類(lèi)似臨床表現(xiàn)，自述無(wú)家族史。本研究采集患兒及父母外周血，并采用本地 50名正常個(gè)體外周血作為對(duì)照。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均征得本人或監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書(shū)。

圖1 患兒 X射線照

圖2 患兒鞏膜及牙齒發(fā)育臨床表現(xiàn)

1.2 標(biāo)本處理

使用5 mL EDTA抗凝管采集患兒及其父母外周血，使用DNA提取商品化試劑盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Germany)，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提取各研究對(duì)象DNA。

1.3 成骨不全相關(guān)基因捕獲測(cè)序

使用超聲波儀將提取的基因組DNA打斷為約100～500 bp小片段，然后通過(guò)磁珠篩選打斷后DNA片段，篩選出主片段大小為150～200 bp，末端補(bǔ)平后在 3' 端加堿基“ A”采用華大基因(BGI，Shenzhen，China)定制芯片與患者DNA庫(kù)于47℃雜交16～24 h，該芯片包含 13個(gè)成骨不全目標(biāo)基因編碼區(qū)及臨近剪接位點(diǎn)區(qū)捕獲探針(表 1)，雜交結(jié)束后進(jìn)行探針洗滌和洗脫反應(yīng)。文庫(kù)經(jīng)片段大小、濃度檢測(cè)，合格后各文庫(kù)進(jìn)行 pooling、定量，然后行單鏈環(huán)化。環(huán)化后的文庫(kù)經(jīng)過(guò)制備形成 DNA納米球，利用高通量測(cè)序儀 BGISEQ-500(BGI，Shenzhen，China)連續(xù)雙向測(cè)序。

1.4 測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)分析

下機(jī)原始數(shù)據(jù)(Raw reads)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，去除低質(zhì)量以及被接頭污染的reads[10]。隨后用BWA軟件(Burrows Wheeler Aligner) 與HG19人類(lèi)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)[11]，GATK軟件進(jìn)行SNV(single nucletide mutation) 和Indel(insertion and deletion)鑒定，生成目標(biāo)區(qū)域堿基多態(tài)性結(jié)果，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI dbSNP，HapMap，1000 human genome dataset和database of 100 Chinese healthy adults)比對(duì)，并對(duì)鑒定出的可疑突變進(jìn)行注釋及篩選，突變致病性評(píng)估是基于ACMG流程[12]。

1.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

使用Oligo7軟件針對(duì)疑似致病突變及周邊區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，對(duì)患兒及其父母基因組DNA進(jìn)行突變區(qū)域特異性 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)，判斷二代測(cè)序鑒定出的疑似致病突變是否真實(shí)，且突變是否符合遺傳規(guī)律。

1.6 基因突變生物功能分析和預(yù)測(cè)

通過(guò)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索、致病突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD和Clinvar)及突變后對(duì)基因表達(dá)翻譯的影響判斷突變功能影響。通過(guò)Human Splicing Finder、Maxant Scan及NNSplice軟件預(yù)測(cè)內(nèi)含子突變對(duì) mRNA剪接的影響及產(chǎn)生新剪接位點(diǎn)可能性。

2 結(jié)果

2.1 基因捕獲高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)過(guò)濾

患兒經(jīng)過(guò) 13個(gè)成骨不全致病基因捕獲測(cè)序，獲得了相關(guān)基因外顯子區(qū)及鄰近 15個(gè)堿基的內(nèi)含子區(qū)域的堿基序列片段，經(jīng)一系列生信過(guò)濾分析，測(cè)序數(shù)據(jù)各質(zhì)量參數(shù)均合格見(jiàn)表1。

2.2 候選基因突變過(guò)濾篩選

鑒定出單堿基突變及 20個(gè)堿基以下缺失插入突變共 22個(gè)，經(jīng)過(guò)分析篩選流程，最終篩選出P3H1基因中一對(duì)復(fù)合雜合突變?yōu)榛純阂伤浦虏⊥蛔儯謩e為c.2164C＞T(p.Q722*) 和c.466-7T＞G，其中突變c.466-7T＞G未有文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道，屬于新突變，見(jiàn)表2。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)值

表2 候選致病變異篩選流程

2.3 家系Sanger測(cè)序驗(yàn)證

針對(duì)c.2164C＞T(p.Q722*)和c.466-7T＞G位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，對(duì)患兒及其父母行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 Sanger測(cè)序驗(yàn)證，其中突變c.2164C＞T(p.Q722*)來(lái)源母親，突變 c.466-7T＞G來(lái)源于父親，見(jiàn)圖3。

2.4 生物信息分析及預(yù)測(cè)

突變 c.2164C＞T(p.Q722*)為無(wú)義突變，導(dǎo)致722位氨基酸提前產(chǎn)生終止密碼子，使得722位及后續(xù)氨基酸無(wú)法翻譯，P3H1蛋白發(fā)生截?cái)唷６蛔僣.466-7T＞G位于內(nèi)含子區(qū)域，經(jīng)預(yù)測(cè)該突變導(dǎo)致新剪接位點(diǎn)產(chǎn)生及原剪接位點(diǎn)破壞可能性較大。其中Human Splice Finder軟件評(píng)估野生型和突變后的CV (consensus value)分別為56.84和85.79(陽(yáng)性閾值為 65)，ΔCV為+50.93%(陽(yáng)性閾值為+10%)。其中Maxant Scan軟件評(píng)估野生型和突變CV(consensus value)分別為-2.32和6.26(陽(yáng)性閾值為 3)，ΔCV為+369.83%(陽(yáng)性閾值為+30%)，見(jiàn)圖4。

3 討論

圖3 家系中P3H1 c.466-7T＞G 和c.2164C＞T (p.Q722*) Sanger測(cè)序圖

圖4 突變c.466-7T＞G基因剪接功能預(yù)測(cè)

P3H1基因編碼脯氨酰-3-羥化酶-1，該蛋白屬于參與膠原生物合成、折疊及組裝的膠原羥化酶家族成員，它與CRTAP蛋白、PPIB蛋白組成膠原蛋白翻譯后修飾復(fù)合體，負(fù)責(zé)對(duì)I型膠原蛋白單個(gè)脯氨酸殘基進(jìn)行羥基化[13-14]。P3H1是一個(gè)常染色體隱性致病基因，該基因純合突變或復(fù)合雜合突變可導(dǎo)致成骨不全 VIII型，通過(guò)檢索 HGMD及 Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)，目前已報(bào)道的P3H1致病性突變已有 60多個(gè)，其中無(wú)義突變、錯(cuò)義突變及剪接位點(diǎn)突變占大多數(shù)。本研究對(duì)疑似成骨不全患者使用成骨不全相關(guān)基因捕獲測(cè)序，通過(guò)生物信息分析及篩選，鑒定出 P3H1基因復(fù)合雜合突變 c.2164C＞T(p.Q722*) 和c.466-7T＞G為疑似致病性突變，患兒其余 12個(gè)成骨不全基因內(nèi)未發(fā)現(xiàn)符合遺傳機(jī)制的突變。

其中 c.2164C＞T(p.Q722*)為無(wú)義突變，2017年Huang等[9]報(bào)道該突變 c.2164C＞T(p.Q722*)和c.105_120del(p.D36Rfs*16) 為1 例產(chǎn)前成骨不全Ⅷ型胎兒的致病突變，他們通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示攜帶該突變患兒 P3H1蛋白表達(dá)缺失，而 mRNA表達(dá)水平并無(wú)顯著降低。Cabral等[13]報(bào)道P3H1的無(wú)義突變會(huì)導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，可能通過(guò)無(wú)義突變介導(dǎo)降解機(jī)制使得mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。Chang等[15]也通過(guò)Western blots和免疫熒光顯微鏡檢測(cè)技術(shù)，證實(shí)P3H1無(wú)義突變可導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低或缺失，而mRNA表達(dá)水平是正常的。通過(guò)上述研究可判斷突變c.2164C＞T(p.Q722*)影響 P3H1蛋白表達(dá)，為成骨不全VIII型致病性突變。

另一突變 c.466-7T＞G位于P3H1的 1號(hào)內(nèi)含子剪切位點(diǎn)區(qū)域，通過(guò)檢索 HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)均未報(bào)道該突變，屬于新突變。通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多篇文獻(xiàn)報(bào)道P3H1基因剪切位點(diǎn)區(qū)域突變?yōu)槌晒遣蝗?VⅢ致病性突變，其中大多數(shù)為剪切供體和受體突變，還有3個(gè)病例研究報(bào)道致病突變位于剪切位點(diǎn)深部區(qū)域(如：c.1170+5G＞C、c.1473+3A＞C和c.2055+18G＞A)[16-18]，其中 c.2055+18G＞A突變可導(dǎo)致 mRNA表達(dá)降低及新的剪接體出現(xiàn)。本研究通過(guò)多個(gè)剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件對(duì)突變 c.466-7T＞G分析，均提示該突變很可能導(dǎo)致新剪接方式產(chǎn)生，從而影響該基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。對(duì)該患兒進(jìn)行隨訪，其父告知患兒已去世，后續(xù)未能繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)功能學(xué)研究。

本研究對(duì)1 例疑似成骨不全患兒使用 13個(gè)成骨不全致病基因高通量測(cè)序，鑒定出P3H1基因內(nèi) 2個(gè)復(fù)合雜合突變，在本地 50例正常對(duì)照(100條染色體)中均未發(fā)現(xiàn)這 2個(gè)突變。其中 c.2164C＞T(p.Q722*)為已報(bào)道的致病性突變，而 c.466-7T＞G未有文獻(xiàn)報(bào)道和數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，但有文獻(xiàn)報(bào)道P3H1基因內(nèi)含子內(nèi)突變影響基因剪切，導(dǎo)致成骨不全 VⅢ型。本研究通過(guò)目前主流基因剪切位點(diǎn)突變功能預(yù)測(cè)軟件，推測(cè)該突變影響P3H1基因的剪切，導(dǎo)致蛋白構(gòu)造及功能發(fā)生改變。由于人體內(nèi)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行，后續(xù)條件允許情況下，可進(jìn)一步在體外細(xì)胞和動(dòng)物水平研究該突變相關(guān)功能。