PtsAGPase 在半夏試管塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析

朱艷芳，李 夏，薛 濤，盛 瑋，薛建平

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北235000）

半夏(Pinellia ternata)是常用的大宗中藥材，具降逆止嘔，燥濕化痰，消除痰濕等功效[1-2]。因而，市場每年的需求量很大，當(dāng)前的半夏產(chǎn)量無法滿足市場需求。半夏的塊莖是其藥用部位，在自然條件下，半夏繁殖率很低，加之野生環(huán)境的破壞和化學(xué)除草劑的使用，野生的半夏資源遭到毀滅性的破壞，導(dǎo)致了半夏塊莖產(chǎn)量嚴(yán)重不足。因此，如何提高半夏的產(chǎn)量成為一個重要的科學(xué)問題[3]。

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)在植物生長發(fā)育過程中起到影響淀粉合成的作用[4-9]。AGPase 在許多植物葉子及貯藏器官中都有存在，AGPase 催化1-磷酸葡萄糖(G-1-P)形成腺苷二磷酸葡萄糖，起到活化葡萄糖的作用使其可以用于淀粉合成[10-16]。AGPase 在淀粉代謝過程中與其他酶類組成了蛋白復(fù)合體，協(xié)同控制淀粉的合成和分解的過程。因而，AGPase 是淀粉生物合成過程中的關(guān)鍵酶，為淀粉合成提供所需的活化葡萄糖供體。

在高等植物中AGPase 由大亞基和小亞基組成異型四聚體，每個亞基都由不同基因編碼，大亞基的作用是調(diào)節(jié)酶的活性，小亞基則是酶的催化中心[17]。在百合鱗莖的生長發(fā)育、膨大過程中，鱗莖中淀粉的含量與AGPase 的表達(dá)量呈正相關(guān)[18]。在玉米、馬鈴薯、小麥等作物中AGPase 均與儲藏器官的發(fā)育過程有一定聯(lián)系，起著促進(jìn)作用，其調(diào)控機(jī)理十分復(fù)雜[19-24]。在馬鈴薯中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因(sAGPase)的表達(dá)與AGPase 的活性是直接相關(guān)的，故可用sAGPase 的表達(dá)反映AGPase 的活性。半夏塊莖發(fā)育過程中，干物質(zhì)不斷合成和積累，淀粉含量會逐步增加。半夏腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因(PtsAGPase)在半夏塊莖的發(fā)育過程中的表達(dá)模式如何，與塊莖的發(fā)育有何關(guān)系？到目前還不清楚。本研究重點(diǎn)探討了PtsAGPase 表達(dá)量與半夏塊莖發(fā)育的關(guān)系。通過研究PtsAGPase 在半夏試管塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)模式，來分析該基因的表達(dá)量與塊莖發(fā)育的關(guān)系，為進(jìn)一步探究半夏塊莖發(fā)育的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

半夏材料由淮北師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和提供的半夏無菌試管苗。

1.2 主要試劑及儀器

TotalRNAExtractor 試劑（生工生物工程上海股份有限公司），無水乙醇，氯仿，異丙醇，DEPC-treat ddH2O，5×All-In-one RT MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABM 生物科技有限公司），Genstar2×Taq PCR Master Mix with Loading Dye(深圳輝諾生物科技有限公司)，瓊脂糖，DL 2000 DNA Marker，溴化乙錠（EB），ddH2O，SolarbioTAE 緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，Vazyme2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

NanoDrop 微量分光光度計、Eppendorf 5430/5430R 高速冷凍離心機(jī)、T100?Thermal Cycler PCR 儀、LightCycler96 實(shí)時熒光定量PCR 儀、ZHJH-C2112C 超凈工作臺、SHH.W21.420 型三用電熱恒溫水浴箱、Tanon-2500 凝膠成像儀、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)與取樣

于超凈工作臺中，剪取葉柄2 cm 倒置接種于塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每瓶接種10 根，將材料在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于塊莖的不同發(fā)育時期（0、5、10、15、20、25 d）取樣，剪取葉柄形態(tài)學(xué)下端，稱量后放入離心管中液氮冷凍保存。為后續(xù)測定半夏塊莖不同發(fā)育時期PtsAGPase 的表達(dá)量提供材料。

同時，分別剪取葉片、葉柄、塊莖，稱量保存，為后續(xù)測定半夏不同部位PtsAGPase 的表達(dá)量提供材料。

1.3.2 總RNA 提取

用Trizol 法提取各樣品的總RNA。將提取的RNA 測定濃度和純度，滿足要求的RNA 于-80 ℃保存。

1.3.3 RNA 的反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄所需的試劑與用量如表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

將半夏塊莖不同發(fā)育時期（0、5、10、15、20、25 d）和半夏不同部位（葉片、葉柄、塊莖）的總RNA分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光定量PCR 引物特異性的檢測

1）本試驗(yàn)使用的熒光定量PCR(polymerase chain reaction)引物是根據(jù)前期半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計而來，由上海生工生物工程有限公司合成。PtsAGPase 的熒光定量PCR 上下游引物序列如下：

PCR 反應(yīng)體系見表2。

2）以半夏不同部位（葉片、葉柄、塊莖）的總RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用sAGP-qPCR-F和sAGP-qPCR-R 作為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以檢測引物的特異性。

表2 PCR 反應(yīng)體系

1.3.5 熒光定量PCR 檢測塊莖不同發(fā)育時期PtsAGPase 的表達(dá)量

將0、5、10、15、20、25d 不同時期反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 用無菌水稀釋20 倍后用作熒光定量PCR 的模板。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書，按表3 中的體系向熒光定量PCR 96 孔板中加入所需的量，使反應(yīng)總體積為每孔10 μL。為了防止材料失活，加樣的步驟需要在冰上進(jìn)行。以18S 基因?yàn)閮?nèi)參，通過熒光定量PCR，檢測半夏試管塊莖不同發(fā)育時期PtsAGPase 的相對表達(dá)量。

表3 熒光定量PCR 反應(yīng)體系

1.3.6 熒光定量PCR 檢測半夏不同部位PtsAGPase 的表達(dá)量

同樣以18S 基因作為內(nèi)參基因，檢測半夏塊莖不同部位（葉片、葉柄、塊莖）PtsAGPase 的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 的質(zhì)量

按照總RNA 提取步驟得到的RNA 通過檢測后A260/A280d 值在1.8～2.0 之間、A260/A230 值在1.8～1.9 之間，表明各樣品提取的總RNA 無降解、無污染、完整性好、質(zhì)量高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 熒光定量PCR 引物特異性的檢測

將PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，每個部位的產(chǎn)物均得到明亮的單一條帶，說明引物特異性高，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 半夏塊莖不同發(fā)育時期的形態(tài)

由圖1 中不同時期的形態(tài)可知，半夏葉柄倒置于塊莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基，5 d 左右進(jìn)入形態(tài)建成期，其形態(tài)學(xué)下端略微發(fā)白，開始有稍許膨大。到10d時其形態(tài)學(xué)下端繼續(xù)膨大，但變化較小，并不明顯。在15 d 左右進(jìn)入快速膨大期，出現(xiàn)明顯膨大，已經(jīng)可以看出小珠芽的形狀。之后20 d 和25 d的小珠芽繼續(xù)膨大，最終形成大小均一、發(fā)育一致的小塊莖。

圖1 半夏塊莖不同發(fā)育時期的形態(tài)

2.4 熒光定量PCR 的測定結(jié)果及分析

2.4.1 PtsAGPase 在半夏塊莖不同發(fā)育時期的表達(dá)模式分析

圖2 為半夏塊莖不同發(fā)育時期，PtsAGPase的表達(dá)量的變化。由圖中看出，PtsAGPase 在5 d（形態(tài)建成期）和15 d（快速膨大期）表達(dá)量為兩個峰值，均極顯著高于對照組，分別為對照組的11倍和35 倍。在10、20 和25 d 表達(dá)量降低，但仍高于對照組表達(dá)量。說明在半夏試管塊莖誘導(dǎo)的不同時期，PtsAGPase 的表達(dá)量均升高，在形態(tài)建成期和快速膨大期尤為顯著。

圖2 半夏塊莖不同發(fā)育時期PtsAGPase 相對表達(dá)量

2.4.2 PtsAGPase 在半夏不同部位表達(dá)模式分析

由圖3 可以看出，PtsAGPase 在半夏塊莖中表達(dá)量最高，是葉柄的69 倍左右；其次為葉片，表達(dá)量是葉柄的26 倍左右，葉柄中表達(dá)量最低；且PtsAGPase 在塊莖和葉片中的表達(dá)量極顯著高于葉柄中的表達(dá)量。說明PtsAGPase 在半夏不同部位的表達(dá)量也有差異，在塊莖中表達(dá)量最高，葉片次之，葉柄中表達(dá)量最低。

圖3 半夏不同部位PtsAGPase 相對表達(dá)量

3 討論

熒光定量PCR 是對PCR 反應(yīng)中每個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測，從而實(shí)現(xiàn)對模板的定量及定性分析[25-28]。

在馬鈴薯的相關(guān)研究中，已知腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亞基基因（sAGPase）的表達(dá)與AGPase 的活性是正相關(guān)的，當(dāng)sAGPase 的表達(dá)量增大時，AGPase 的活性升高，且馬鈴薯塊莖中的淀粉含量會隨之增大；反之則減少。所以，sAGPase 表達(dá)量可以反映AGPase 的活性，從而影響馬鈴薯中淀粉與還原糖的轉(zhuǎn)化。在馬鈴薯中sAGPase 的表達(dá)量與馬鈴薯塊莖中淀粉合成呈正相關(guān)[29]。在玉米相關(guān)的研究中，也發(fā)現(xiàn)即使品種不同，但在玉米胚乳生長發(fā)育過程中sAGPase 的表達(dá)量均顯著性增高。同樣，在小麥籽粒灌漿期時sAGPase 的表達(dá)量有明顯的升高，籽粒中AGPase 的活性明顯增大，并且與籽粒中淀粉的合成速率呈正相關(guān)[30]。由此看來，sAGPase 與植物貯藏器官的生長發(fā)育有著密切的聯(lián)系，能夠促進(jìn)植物淀粉合成，同時促進(jìn)貯藏器官生長發(fā)育。

對熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并結(jié)合半夏塊莖不同發(fā)育時期的形態(tài)特征，結(jié)果顯示PtsAGPase 在半夏塊莖發(fā)育過程中表達(dá)量有明顯升高，且在半夏塊莖形態(tài)建成期、快速膨大期表達(dá)量極顯著升高，與半夏塊莖生長發(fā)育形態(tài)變化相對應(yīng)。說明PtsAGPase 表達(dá)量與半夏塊莖發(fā)育有明顯關(guān)系。

在半夏塊莖發(fā)育過程中，其干物質(zhì)會不斷累積增加，淀粉也在不斷合成和積累，結(jié)合半夏不同時期、不同部位PtsAGPase 的表達(dá)量分析，PtsAGPase 與半夏塊莖的發(fā)育有明顯聯(lián)系，推測PtsAGPase 的表達(dá)量增大會使PtAGPase 的活性增大，促進(jìn)半夏塊莖中葡萄糖向淀粉轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)淀粉的合成，對半夏塊莖發(fā)育起促進(jìn)作用。但是在半夏塊莖發(fā)育過程中，PtsAGPase 的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚，需進(jìn)行深入研究。

4 小結(jié)

由半夏塊莖不同發(fā)育時期的形態(tài)和PtsAGPase 表達(dá)模式分析的數(shù)據(jù)可知，PtsAGPase 的表達(dá)與半夏塊莖發(fā)育時期相互關(guān)聯(lián)，在半夏塊莖的形態(tài)建成期和快速膨大期PtsAGPase 的表達(dá)量極顯著升高。PtsAGPase 的表達(dá)促進(jìn)淀粉的合成和積累，促進(jìn)了半夏塊莖的發(fā)育，但并未明確其調(diào)控機(jī)理。本研究為后續(xù)半夏塊莖發(fā)育過程調(diào)控機(jī)理的研究提供參考。