3 種雁艾美爾球蟲(chóng)ITS 序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

李清月，龔治忠，劉 剛

（安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥230032）

鳥(niǎo)類腸道寄生蟲(chóng)是最常見(jiàn)、對(duì)其威脅最為明顯的病原體之一。研究表明，寄生蟲(chóng)不僅可以感染鳥(niǎo)類，而且還可以感染哺乳動(dòng)物甚至人類，具有重要的公共衛(wèi)生意義[1]。幾乎所有的野鳥(niǎo)和家養(yǎng)鳥(niǎo)類都能感染球蟲(chóng)病，球蟲(chóng)病的病原體主要是艾美爾球蟲(chóng)屬（Eimeria）[2-3]。艾美爾球蟲(chóng)是一種專性細(xì)胞內(nèi)原生寄生蟲(chóng)，主要寄生在鳥(niǎo)類的小腸壁，生命周期較復(fù)雜，可以通過(guò)“糞-口”傳播方式在動(dòng)物間傳播[4-5]。人類感染艾美爾球蟲(chóng)早期癥狀不明顯，嚴(yán)重時(shí)會(huì)出現(xiàn)胃腸道不適或者慢性腹瀉、厭食、倦怠等癥狀；有時(shí)可引起發(fā)熱、持續(xù)性或者脂肪性腹瀉等急性感染癥狀，甚至?xí)?dǎo)致死亡[6]。

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法鑒定寄生蟲(chóng)存在一定的局限性，尤其是某些相似或近緣物種較為困難；此外，在鏡檢時(shí)球蟲(chóng)的卵囊必須從糞便中分離出來(lái)且進(jìn)行孢子的孵育，處理過(guò)程十分繁瑣，不適合規(guī)?；瘷z測(cè)[7]。目前，關(guān)于艾美球蟲(chóng)屬物種的分子鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究相關(guān)工作還比較有限且存在爭(zhēng)議，部分學(xué)者推測(cè)艾美爾球蟲(chóng)屬具有單起源特性[8-10]，也有學(xué)者認(rèn)為艾美爾球蟲(chóng)可能存在多種起源[11]。如，18S rDNA 基因構(gòu)建的兔球蟲(chóng)進(jìn)化樹(shù)顯示，外殘?bào)w可以反映球蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，其他形態(tài)學(xué)特征對(duì)球蟲(chóng)進(jìn)化關(guān)系的確定影響不明顯[12]；有研究人員發(fā)現(xiàn)地域的差異性對(duì)于印度雞球蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系影響不大[6]；國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)寄生于腸道的兔艾美爾球蟲(chóng)親緣關(guān)系近，而寄生于肝臟的球蟲(chóng)則形成單獨(dú)的進(jìn)化枝[13]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于遷徙鳥(niǎo)類艾美爾球蟲(chóng)物種鑒定和分類還存在一些爭(zhēng)議，系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系尚不明確。

本課題組專注于長(zhǎng)江中下游越冬白額雁（Anser albifrons）腸道寄生蟲(chóng)流行病學(xué)研究，前期研究發(fā)現(xiàn)在白額雁越冬地濕地的周邊有大量的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，常出現(xiàn)飼養(yǎng)家禽和白額雁在相同水域混群覓食的現(xiàn)象，這種混群行為增加了寄生蟲(chóng)相互傳播的機(jī)會(huì)（尚未發(fā)表），大量研究表明，候鳥(niǎo)和飼養(yǎng)家禽在寄生蟲(chóng)的傳播中起著重要的作用，造成寄生蟲(chóng)疾病在家禽、候鳥(niǎo)之間周期性的暴發(fā)和循環(huán)感染[14-16]，因此候鳥(niǎo)攜帶的腸道寄生蟲(chóng)可能帶來(lái)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。由于傳統(tǒng)分類方法對(duì)于寄生蟲(chóng)的物種鑒定還存在一定難度，因此，遷徙鳥(niǎo)類的腸道寄生蟲(chóng)鑒定需要更迅速、準(zhǔn)確和效率更高的鑒定方法，大量研究表明ITS（internal transcribed spacer)基因序列具有較高的穩(wěn)定性和種間特異性[17-19]，可以作為研究屬、種分類階元的理想遺傳標(biāo)記[20-21]。設(shè)計(jì)ITS 基因特異性引物，不僅用來(lái)鑒定寄生蟲(chóng)的種類，而且可以研究寄生蟲(chóng)物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，ITS 基因序列正在成為寄生蟲(chóng)學(xué)研究的主要標(biāo)記基因[20-21]。本研究擬通過(guò)分子生物學(xué)方法，鑒定升金湖和菜子湖越冬白額雁腸道內(nèi)攜帶的艾美爾球蟲(chóng)種類，并闡明艾美爾球蟲(chóng)屬部分物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018 年11 月，采取無(wú)創(chuàng)采樣技術(shù)采集來(lái)自安徽省升金湖王壩村（30°16'58.89''N，117°0'14.64''E）和菜子湖羅嶺鎮(zhèn)（30°75'00.11.44''N，117°08'64.25.78''E）越冬白額雁的糞便樣本。在采集糞便樣品前，用雙筒或單筒望遠(yuǎn)鏡觀察覓食雁群至少1 h，確定周圍沒(méi)有其他鳥(niǎo)群活動(dòng)，或與其他集群有明顯的障礙物（如田埂、河溝等）間隔后方能采集，根據(jù)白額雁的足跡或覓食坑，確定為覓食地點(diǎn)。戴一次性PE 手套仔細(xì)辨別并采集新鮮糞便樣本，每采集一份更換一次手套，去除接觸地面的部分后，將糞便樣本放置于50 mL 無(wú)菌離心管中，貼上標(biāo)簽，放于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)采集地來(lái)源及采集時(shí)間整理分裝，短期內(nèi)不能檢測(cè)的樣本放置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及球蟲(chóng)鑒定

采集的白額雁糞便樣品共700 份左右，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選出具有代表性的3 種艾美爾球蟲(chóng)序列：升金湖S49 樣品，升金湖S5 樣品，以及菜子湖C70 樣品。為保證環(huán)境對(duì)寄生蟲(chóng)的影響，樣品均為越冬前期所采集的白額雁糞便。采用來(lái)自TIANamp Stool DNA 試劑盒（Tiangen Biotech CO，LTD）從糞便樣品中提取總DNA，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的艾美爾球蟲(chóng)屬I(mǎi)TS 基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-AAG TTG CGT AAA TAG AGC CCT C-3’，下游引物：5’-CAA GAC ATC CAT TGC TGA AAG T-3’。PCR 擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，dNTP mixture（2.5 mmol/L）各4 μL，引物各（10 μmol/L）1 μL，rTaq DNA 聚合酶0.5 U，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水32.5 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后送通用生物系統(tǒng)有限公司（安徽）進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)獲得的ITS 基因序列進(jìn)行BLAST 搜索，參考置信區(qū)間為100%的序列，推斷3 種球蟲(chóng)的物種。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

下載NCBI 上已釋放的艾美爾球蟲(chóng)屬I(mǎi)TS 基因序列如表1。

表1 22 種艾美爾球蟲(chóng)ITS 序列的GenBank 登錄號(hào)

以Isospora anthochaerae（GenBank 登錄號(hào)為KF766051）為外群，用CLUSTALX 2.1 軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)用DNAStar 軟件對(duì)不同序列進(jìn)行相似性分析。用Mega 5.0 軟件對(duì)比對(duì)后的序列進(jìn)行修剪并轉(zhuǎn)換成.nex 格式備用。用Mega 5.0軟件對(duì)形成的.nex 格式文件進(jìn)行數(shù)據(jù)模型選擇，最終選取AIC 模式下的模型，將其應(yīng)用于系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建。最大似然（maximum likelihood，ML）法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)采用PAUP 4.10 軟件，建樹(shù)前先使用Modeltest v 3.7 選擇最優(yōu)模型，然后將所得最優(yōu)模型寫(xiě)入PAUP 4.10 軟件命令行中，進(jìn)行最大似然法（ML 樹(shù)）建樹(shù)，建樹(shù)執(zhí)行快速支持度分析并在一次單獨(dú)的程序運(yùn)行中搜索最佳分值的ML 樹(shù)的方法，自舉檢驗(yàn)100 次。貝葉斯推論（Bayesian inference，BI）法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)（用MrBayes 3.1.2 軟件建立，建樹(shù)前使用Modeltest v3.7 選擇最優(yōu)模型，運(yùn)行4 個(gè)馬爾可夫鏈，運(yùn)行100 萬(wàn)代，直至標(biāo)準(zhǔn)誤差小于0.01，每2 500 代抽樣一次，舍棄老化樣本構(gòu)建一致樹(shù)。

2 結(jié)果

參考GenBank 上釋放的艾美爾球蟲(chóng)屬各球蟲(chóng)置信區(qū)間最高的ITS 序列，推斷出3 種艾美爾球蟲(chóng)分離株的物種：菜子湖C70 株為橢圓艾美爾球蟲(chóng)（E.alabamensis），升金湖S49 株為柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（E.tenlla），升金湖S5 株為和緩艾美爾球蟲(chóng)（E. mitis）。三條序列上傳至Genbank，登錄號(hào)為MN598760～MN598762。橢圓艾美爾球蟲(chóng)（E.alabamensis）擴(kuò)增出ITS 基因片段長(zhǎng)度為419 bp，柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（E. tenlla）ITS 基因片段長(zhǎng)度為271 bp，和緩艾美爾球蟲(chóng)（E.mitis）ITS 基因片段長(zhǎng)度為344 bp。另外，E. alabamensis 堿基AT 含量為64.0%，GC 含量為36.0%，E.tenlla 堿基AT 含量為60.2%，堿基GC 含量為39.8%，E.mitis 堿基AT 含量為55.3%，GC 含量為44.7%，本研究中22種艾美爾球蟲(chóng)分離株堿基AT 含量最高為67.8%，堿基GC 含量最高為53.8%，堿基AT 平均含量（58.4%）略高于GC 平均含量（41.5%）如表2。

表2 22 種艾美爾球蟲(chóng)分離株ITS 序列的堿基含量

3 種艾美爾球蟲(chóng)ITS 序列中堿基A+T 含量為59.83%，G+C 含量為40.16%，與大多數(shù)艾美球蟲(chóng)ITS 序列堿基組成含量相似如表2。

遺傳距離分析表明，E. alabamensis 菜子湖C70 株與Genbank 中的家鵝分離出的E.stigmosa和博金斯牛E. subspherica 基因型（登錄號(hào)AB769806）遺傳距離為0.15，遺傳差異較小，親緣關(guān)系最近，E. tenlla 升金湖S49 株與Genbank 中的穴兔分離出的E.magna 遺傳距離0.85，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，E.mitis 升金湖S5 株與Genbank 中的家鵝分離出的E. hermani 以及穴兔分離出的E.magna 基因型遺傳距離為0.21，親緣關(guān)系最近如表3。3 種球蟲(chóng)ITS 序列種間差異性較大，ITS序列可作為這3 種白額雁球蟲(chóng)鑒別的分子標(biāo)記。

表3 22 種艾美耳球蟲(chóng)ITS 基因序列的遺傳距離

構(gòu)建的ML 和BI 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和較高的支持率，其中ML 樹(shù)分為3 枝，第1 枝包括分離自羊的E.arloingi，分離自博金斯牛的E.bovis，E.cylindrica 和E.canadensis。第2 枝包含分離自家鵝的E. hermani，分離自白額雁的E.tenlla，E.alabamensis 和E.mitis，分離自火雞的E. dispersa，分離自家鵝的E. fulva，E. anseris 和E. stigmosa。第3 枝由分離自雞的E. media，E.maxima，E. necatrix，分離自牛的E. wyomingensis 及 分 離 自 兔 的E.flavescens，E.piriformis 組成，該進(jìn)化枝的宿主均為哺乳動(dòng)物，形成了一個(gè)高度支持值的分枝。此外，艾美爾球蟲(chóng)菜子湖C70株（E.alabamensis）與Genbank 中的家鵝分離出的E. stigmosa（KP789173）和博金斯牛分離出的E.subspherica（AB769806）親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹(shù)中處于同一進(jìn)化枝（自舉值為99%）；艾美爾球蟲(chóng)升金湖S49 株（E.tenlla）形成單獨(dú)的分枝；艾美爾球蟲(chóng)升金湖S5 株（E.mitis）與Genbank 中的家鵝分離出的E.hermani（KF977223）以及穴兔分離出的E.magna（JX406876）親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹(shù)中處于同一進(jìn)化枝上（自舉值為99%）見(jiàn)圖1。BI樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與ML 樹(shù)相似見(jiàn)圖2，3 種來(lái)自白額雁的艾美爾球蟲(chóng)均與家鵝中的艾美爾球蟲(chóng)親緣關(guān)系較近，共同匯聚成一大進(jìn)化枝，并且與寄生于哺乳動(dòng)物如兔，山羊等艾美爾球蟲(chóng)物種距離較遠(yuǎn)。ML 樹(shù)和BI 樹(shù)的結(jié)果表明，艾美爾球蟲(chóng)ITS 基因序列在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上也表現(xiàn)出較低的種內(nèi)變異性和較高的種間變異性。

圖1 最大似然法（ML）構(gòu)建的艾美爾球蟲(chóng)屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 貝葉斯法（BI）法構(gòu)建的艾美爾球蟲(chóng)屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

寄生蟲(chóng)疾病已成為嚴(yán)重威脅野生動(dòng)物和人類健康的全球性難題，研究表明，寄生蟲(chóng)不僅可以感染野生鳥(niǎo)類和家禽，而且具有感染哺乳動(dòng)物和人的能力，對(duì)人類的威脅也在不斷增加，具有重要的公共衛(wèi)生意義[22]。分子標(biāo)記法是根據(jù)寄生蟲(chóng)基因特征或者核苷酸序列的差異來(lái)確定物種和基因型，ITS 基因序列具有種間特異性和種內(nèi)多樣性，能精準(zhǔn)反應(yīng)種間或群體間的進(jìn)化關(guān)系，因此，ITS基因是目前寄生蟲(chóng)鑒定的重要分子標(biāo)記[23-24]。從基因水平證實(shí)艾美爾球蟲(chóng)菜子湖C70 株為橢圓艾美爾球蟲(chóng)（E. alabamensis），艾美爾球蟲(chóng)升金湖S49 株為柔嫩艾美爾球蟲(chóng)（E.tenlla），艾美爾球蟲(chóng)升金湖S5 株為和緩艾美爾球蟲(chóng)（E.mitis），3 株艾美爾球蟲(chóng)的ITS 序列與GenBank 上釋放的其它球蟲(chóng)物種的ITS 序列相比變異性較低，與很多學(xué)者研究中的ITS 序列具有較高的穩(wěn)定性和種間特異性的結(jié)論相一致[24-25]。利用ITS 基因進(jìn)行分析，并且與GenBank 上已登錄的艾美爾球蟲(chóng)序列相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與所獲得的序列同源性均很高，從生物信息學(xué)角度證明ITS 基因序列可以提供有效的遺傳數(shù)據(jù)，能夠解決與鳥(niǎo)類相關(guān)的艾美爾球蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)和群體遺傳學(xué)中的進(jìn)一步問(wèn)題。豐富了遷徙鳥(niǎo)類球蟲(chóng)的核糖體ITS 序列，為鳥(niǎo)類球蟲(chóng)的分類鑒定、分子流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

應(yīng)用ITS 基因不僅能夠鑒定球蟲(chóng)的物種，還可以用來(lái)分析球蟲(chóng)不同物種之間的親緣關(guān)系，為球蟲(chóng)的分子遺傳學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)[26]。目前對(duì)于遷徙鳥(niǎo)類體內(nèi)球蟲(chóng)物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的研究不多，且艾美爾球蟲(chóng)起源的也存在爭(zhēng)議，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明艾美爾球蟲(chóng)E.mitis，E.tenella 和E.alabamensis 與家鵝體內(nèi)的艾美爾球蟲(chóng)匯聚為一枝，親緣關(guān)系較密切，來(lái)自鳥(niǎo)類的E. mitis，E. tenella 和E.alabamensis 遠(yuǎn)離宿主為哺乳動(dòng)物的E.arloingi，E. bovis，E.Cylindrica 以及E.canaclensis，表明樹(shù)中所有艾美爾球蟲(chóng)均來(lái)自同一祖先，因此，本研究支持艾美爾球蟲(chóng)為單起源的觀點(diǎn)[8-10]。其中一些物種聚集成與寄生蟲(chóng)宿主相關(guān)的進(jìn)化枝（例如，從鳥(niǎo)糞便中分離的物種），且宿主為鳥(niǎo)類的球蟲(chóng)物種均匯聚為一大進(jìn)化枝，而寄生于哺乳動(dòng)物的球蟲(chóng)物種則形成一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化枝，并且發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)與宿主的進(jìn)化程度也很相似，因此艾美爾球蟲(chóng)物種與宿主之間存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。

4 小結(jié)

本研究鑒定出越冬白額雁體內(nèi)3 種艾美爾球蟲(chóng)并對(duì)其進(jìn)行基因序列特征和部分物種的關(guān)系進(jìn)行了分子系統(tǒng)學(xué)分析，證實(shí)了ITS 基因序列可作為鳥(niǎo)類艾美耳球蟲(chóng)鑒定可靠的遺傳標(biāo)記，也為寄生蟲(chóng)的物種鑒定及流行病學(xué)研究提供了重要的理論依據(jù)。同時(shí)我們利用生物信息學(xué)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)表明所有艾美爾球蟲(chóng)均來(lái)自同一祖先，支持艾美爾球蟲(chóng)為單起源觀點(diǎn)。此外，本研究以糞便為非損傷取樣，對(duì)糞便學(xué)的研究結(jié)果起到了補(bǔ)充作用?？傊芯恳吧蕉B(niǎo)類寄生蟲(chóng)具有重要的公共衛(wèi)生意義，尤其是隨著研究的不斷深入，一些新的寄生蟲(chóng)將不斷的被發(fā)現(xiàn)，而寄生蟲(chóng)各個(gè)蟲(chóng)種或基因型分子特性以及生物學(xué)特性的不斷闡明，將有助于人獸共患寄生蟲(chóng)病互傳機(jī)制的研究，從而為預(yù)防人寄生蟲(chóng)疾病乃至治療人寄生蟲(chóng)疾病奠定必要的基礎(chǔ)。