“魯保一號”菌株的鑒定和生防增效助劑篩選

李健，高興祥，李美，房鋒

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南 250100)

菟絲子是菟絲子屬(Cuscutasp.)植物的通稱，能夠通過吸器汲取寄主的養(yǎng)分，是一類危害嚴(yán)重的惡性寄生性雜草。菟絲子廣泛分布于我國黑龍江、甘肅、山東、江蘇、湖南、湖北、江西、廣東等多個省份，對多種作物、牧草、中草藥和觀賞植物的生長構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-3]。菟絲子生活力極強(qiáng)，且易與寄主產(chǎn)生緊密的寄生關(guān)系，化學(xué)除草劑不僅很難從根本上防除菟絲子，還易對宿主植物造成藥害，且缺乏能夠高效控制菟絲子的化學(xué)藥劑。目前我國對環(huán)境友好型生物農(nóng)藥的研發(fā)越發(fā)關(guān)注，市場上對其生物防治的需求較高[4]。

“魯保一號”[5]是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉志海等人于1963年研制成功的一種對菟絲子有特殊防效的微生物菌劑[6-8]。20世紀(jì)60年代中、后期，曾在山東、江蘇、安徽、寧夏等20多個省區(qū)開展了“魯保一號”菌劑的生產(chǎn)和應(yīng)用，對控制菟絲子的蔓延和危害起到一定作用[8]。雖然“魯保一號”菌株具有較高的應(yīng)用價值和經(jīng)濟(jì)價值，但由于其應(yīng)用較早，對其防控效果和致病力方式描述較少。

農(nóng)藥助劑(pesticide adjuvant)是指能夠改善農(nóng)藥性能、增強(qiáng)農(nóng)藥應(yīng)用效果的一類在農(nóng)藥田間應(yīng)用過程中除農(nóng)藥原藥成分之外的其他輔助物[9,10]。目前微生物農(nóng)藥助劑應(yīng)用較為廣泛多樣，對相關(guān)生物農(nóng)藥劑型的改進(jìn)和防效的增強(qiáng)具有重要作用[11-13]。但在生物農(nóng)藥助劑應(yīng)用過程中，要防止助劑對微生物活性的影響，因此篩選與相應(yīng)微生物具有相容性的助劑至關(guān)重要[14]。本試驗對“魯保一號”菌株進(jìn)行重鑒定，研究其對菟絲子的防控效果和對多種作物的安全性，并篩選出合適的增效助劑，為其深入開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株“魯保一號”保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。供試宿主為菟絲子；安全性檢測作物為大豆、玉米、小麥、水稻、柑橘、蘋果、梨樹、冬青、黑麥草。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

病原菌分子水平鑒定所需試劑購自日本TaKaRa公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

本試驗用相關(guān)助劑由本實驗室保存或購自相應(yīng)農(nóng)藥公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分子鑒定 采用PDA培養(yǎng)基活化并擴(kuò)大培養(yǎng)“魯保一號”菌株，提取其基因組 DNA[14]，應(yīng)用表1引物分別擴(kuò)增28S rRNA 基因LSU(GenBank：MT458694)和甘油醛三磷酸脫氫酶基因GAPDH(GenBank：MT459804)的序列。反應(yīng)體系(20 μL)：10 × buffer 2 μL，dNTP 1 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 94℃ 4 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，29個循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，BLAST 比對分析，并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對該菌進(jìn)行鑒定。

表1 本試驗所用引物序列

1.2.2 致病力和安全性測定 PDA培養(yǎng)基活化“魯保一號”菌株，7 d后，用0.1%吐溫80配置濃度為1×106個/mL的分生孢子液，按照每666.7m245 L用量均勻噴灑于菟絲子和安全性檢測作物表面。3 d后觀察侵染位置，7 d和14 d后觀察并記錄安全性檢測效果。

1.2.3 農(nóng)藥助劑對孢子萌發(fā)的影響 PDA培養(yǎng)基活化“魯保一號”菌株。根據(jù)不同助劑田間使用倍數(shù)，配制含有相應(yīng)助劑的濃度為1×106個/mL的孢子液，25℃黑暗培養(yǎng)，24 h后記錄分生孢子萌發(fā)數(shù)。

孢子萌發(fā)率(%)=處理組萌發(fā)數(shù)/對照組萌發(fā)數(shù)×100。

1.2.4 農(nóng)藥助劑對防效的影響 PDA培養(yǎng)基活化“魯保一號”菌株。根據(jù)不同助劑田間使用倍數(shù)，配制含有相應(yīng)助劑的濃度為1×106個/mL的孢子液，按照每666.7m245 L用量均勻噴灑于菟絲子上。3 d后計算感病率，即每2 cm菟絲子莖上的病斑率。14 d后統(tǒng)計鮮重防效：隨機(jī)挑選防治組和對照組相同長度(各3條，每條15～20 cm)的菟絲子，每個處理重復(fù)3次。

鮮重防效(%)=(對照平均鮮重-處理平均鮮重)/對照平均鮮重×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS統(tǒng)計軟件分析不同處理間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 “魯保一號”菌株鑒定

基于LSU和GAPDH基因的進(jìn)化樹(圖1)顯示，該菌與尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)進(jìn)化關(guān)系最近，從分子生物學(xué)水平上將該菌株進(jìn)一步鑒定為尖孢炭疽菌菟絲子?；?C.acutatumsp.cuscuta)。

A:LSU基因遺傳進(jìn)化分析; B:GAPDH基因遺傳進(jìn)化分析;Colletotrichumpyricola: 梨炭疽菌;Colletotrichumfioriniae: 油茶炭疽菌;Colletotrichumkniphofiae:刀狀炭疽菌;Colletotrichumorchidophilum: 蘭花炭疽菌:Colletotrichumhigginsianum: 希金斯炭疽菌;Colletotrichumaotearoa: 奧特阿羅刺盤孢菌;Colletotrichumgloeosporioides: 膠孢炭疽菌;Colletotrichumsiamense: 橡膠樹炭疽菌;Colletotrichumacutatum: 尖孢炭疽菌;Colletotrichumvietnamense: 兜蘭炭疽菌;Colletotrichumdematium: 束狀刺盤孢;Colletotrichumtruncatum: 大豆炭疽病菌;Colletotrichumbrevisporum: 百香果炭疽菌;Monilochaetesguadalcanalensis:瓜達(dá)卡納爾瓶梗附孢。

圖1“魯保一號”菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 致病力和安全性分析

接菌3 d后，“魯保一號”菌株即可完成對菟絲子的侵染，導(dǎo)致侵染部位呈褐色并逐漸干枯，接菌14 d后，多數(shù)菟絲子枯死(圖1A)，鮮重防效可達(dá)67.6%?！棒敱Ｒ惶枴本昕梢酝ㄟ^菟絲子莖表面完成侵染過程，并形成近橢圓形病斑，病斑邊緣呈深褐色(圖2B)；該菌能夠通過菟絲子侵染過程中形成的吸器入侵菟絲子，導(dǎo)致菟絲子吸器部位黑化(圖2C)。多種植物的安全性試驗顯示，“魯保一號”對大豆、玉米、小麥、水稻、梨樹、冬青和黑麥草安全；接菌3 d后柑橘、蘋果葉片雖產(chǎn)生暗黑色小斑點，但是后期未擴(kuò)展，未造成葉片病死，總體安全。

2.3 不同助劑對孢子萌發(fā)和防效的影響

本試驗研究了目前田間常用的12種助劑，既包括常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥助劑，也包含微生物農(nóng)藥專用助劑。孢子萌發(fā)試驗顯示，常規(guī)田間推薦使用濃度下，多數(shù)助劑不影響孢子的萌發(fā)，僅兩種助劑(省功寶和G-1801)對孢子的萌發(fā)產(chǎn)生顯著影響(表2)。

A：接菌14 d后致病效果觀察；B：莖侵染病斑；C：吸器侵染。

防效試驗顯示，有機(jī)改性硅聚醚和Silwet 408對其防效有一定的增進(jìn)作用，其它助劑無效或會影響該菌株的防效(表2)。

表2 助劑對孢子萌發(fā)和防效的影響

3 討論與結(jié)論

“魯保一號”菌株是我國第一個大規(guī)模應(yīng)用的生物除草劑，在我國乃至世界范圍內(nèi)的生物除草劑研究過程中具有舉足輕重的地位，但是因其應(yīng)用年代較為久遠(yuǎn)，對于其致病方式、防控效果的評價缺乏直觀圖文描述[1-3]。早期將“魯保一號”菌株鑒定為膠孢炭疽菌[15]，但缺乏對于其形態(tài)描述和分子生物學(xué)鑒定的相關(guān)數(shù)據(jù)。本試驗克隆了廣泛應(yīng)用于真菌分類的相關(guān)基因LSU和GAPDH[16,17]，結(jié)合早期克隆的ITS序列[5]，通過分析進(jìn)一步將該菌株確定為尖孢炭疽菌菟絲子?；?C.acutatumsp.cuscuta)。

本研究首次報道了“魯保一號”菌株初侵染部位和防控效果，結(jié)果顯示該菌株防控菟絲子效果顯著。近些年，菟絲子危害越發(fā)嚴(yán)重[18]，“魯保一號”菌株能夠通過菟絲子吸器部位直接侵入內(nèi)部，從根源處殺死菟絲子，且不造成宿主作物的藥害發(fā)生，說明該菌具有廣泛的應(yīng)用價值。篩選高性能的“魯保一號”菌可用助劑對于其進(jìn)一步應(yīng)用具有重要作用。良好的助劑不僅能增強(qiáng)生防菌的致病力，而且有助于保護(hù)生防菌的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)生物農(nóng)藥的高效應(yīng)用[19]。本試驗明確了少數(shù)助劑可能抑制孢子的萌發(fā)，因此初步篩選至關(guān)重要，進(jìn)一步的防效篩選得到兩種增效助劑，對于“魯保一號”菌株的生產(chǎn)應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。目前，我國對于環(huán)境友好型生物除草劑的需求越來越高，本研究表明該菌株具備再開發(fā)利用的潛力。