棘胸蛙歪頭病病原菌分離及單克隆抗體制備

李秋晴，田 葦，趙正億，鄭榮泉，3，4通信作者

(1.浙江師范大學，浙江 金華 321004；2.貴州黔東南橋水農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司，貴州 黔東南 556000；3.浙江省野生動物生物技術(shù)與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004；4.浙江師范大學行知學院，浙江 金華 321100)

1 概述

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，在分類上屬于兩棲綱(Amphibia)、無尾目(Anura)、叉舌蛙科(Dicroglossidae)、棘胸蛙屬(Quasipaa)[1]，是我國特有的兩棲類動物，俗稱石蛙、棘蛙。在棘胸蛙人工養(yǎng)殖中，大部分養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟效益而進行密度養(yǎng)殖，同時存在養(yǎng)殖設備老舊，養(yǎng)殖水體循環(huán)不暢等問題，導致棘胸蛙患病率大大增加。國內(nèi)已相繼報道了棘胸蛙的腹水病、腦膜炎、紅腿病、腸胃炎、出血病、肝腫大病及愛德華氏菌病等蛙類疾病。歪頭病(腦膜炎)是目前蛙類中危害較大的疾病之一，該病主要癥狀是蛙頭部歪斜，泳動時身體打轉(zhuǎn)，失去平衡力，同時還有白內(nèi)障等并發(fā)癥，致死率高，傳播迅速。不同研究者從具有該類癥狀的病蛙中分離出至少9種具致病力的細菌，其中腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)最多見[2]。如張奇亞等[3]在患有“旋游癥”的美國青蛙的腦組織分離到了腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)，即腦膜炎敗血伊麗莎白金菌。葉雪平[4]報道的由該菌引起的牛蛙發(fā)病，具有歪頭、膚色發(fā)黑的現(xiàn)象。李明[5]、宋婷婷[6]也報道了由該菌引起的棘胸蛙歪頭病，此外，他們還發(fā)現(xiàn)除口服方式外，皮膚損傷或不損傷浸泡及肌肉注射都能導致棘胸蛙發(fā)病。同時研究還發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血伊麗莎白金菌具有強耐藥性[7]。在實際的養(yǎng)殖過程中也發(fā)現(xiàn)該病菌一旦感染，抗生素防治效果不佳的情況。

目前為止，棘胸蛙歪頭病感染的腦膜炎敗血伊麗莎白金菌的單克隆抗體和免疫組織化學技術(shù)方面的研究尚屬空白，對腦膜炎敗血伊麗莎白金菌開展相關(guān)技術(shù)研究，在棘胸蛙歪頭病診斷防治中具有較好的應用價值和理論價值。

2 材料和方法

2.1 試驗動物及細菌

患病的棘胸蛙樣本采集于浙江省某棘胸蛙養(yǎng)殖場，Balc/b小白鼠購于金華實驗動物中心，Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞購于Sigma公司，試驗用嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌由浙江省特種水產(chǎn)研究實驗室提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 病蛙細菌分離、純化及鑒定

對病蛙進行解剖，觀察病蛙是否具有內(nèi)臟病變。在無菌條件下，取病蛙的腦、眼睛、肝臟、腎臟等組織，取樣劃線分離于普通營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，得到單菌落。觀察菌落的大小、顏色、干濕、形態(tài)等菌落特征，并接種于斜面培養(yǎng)基，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

對細菌采用梅里埃微生物自動鑒定系統(tǒng)，按照說明書對所分離得到的細菌進行生理生化實驗，對細菌進行鑒定。

2.2.2 棘胸蛙腦膜炎致病菌單克隆抗體制備

取滅活的腦膜炎敗血伊麗莎白金菌注射Balc/b小鼠，共注射4次，每次間隔1周，以濃度為1×109CFU/mL的菌懸液與弗氏完全佐劑1∶1混合為注射液，每次劑量為0.1 mL，最后一次免疫后第3天取脾臟用于細胞融合[8]。

取良好的骨髓瘤細胞以及小鼠脾細胞，按比例為5：1進行混合勻化細胞，緩慢加入HAT培養(yǎng)基重懸，輕輕混勻，并加入預先準備好的細胞培養(yǎng)板中。每10 mL移液管中加入1孔(每孔8 mL)，并將80～100 μL(含10 mL/平板)加入配好的細胞培養(yǎng)板中，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育并觀察。

在細胞融合后的第1天，觀察細胞，記錄細胞的生長狀態(tài)。培養(yǎng)3～5 d換細胞培養(yǎng)液HAT，10 d為HT，20 d改為1640完全培養(yǎng)基[9]。

2.2.3 篩選分泌抗體的雜交瘤細胞及抗體特異性檢測

取未滅活的致病菌，使用無菌水制成1×109CFU/mL的菌懸液，用包被液稀釋10倍后取100 μL加入96孔酶標版各孔中，4℃過夜后，洗液洗滌3次。每孔加200 μL或加滿封閉液，37℃ 2 h后，洗滌3次，拍干。置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

選取上實驗中陽性雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清液50～100 μL/孔加樣到包被好的酶標板中，采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測抗原活性，將遲緩愛德華氏菌，嗜水氣單胞菌，每孔加200μL或加滿封閉液，包被于96孔酶標板中，讀取各孔OD值，與陰性及陽性數(shù)據(jù)進行計算對照。

3 結(jié)果與分析

3.1 病原菌的分離與鑒定

本實驗于無菌操作下取患有歪頭病的棘胸蛙各組織進行劃線分離，其中從腦組織分離培養(yǎng)獲得了大量菌落，推測該部分細菌的感染造成棘胸蛙歪頭癥狀；從腦組織(推測造成腦損傷)、肝臟中分離得到了少許菌落。分離所得菌落大小、形態(tài) 、顏色、干濕度均相似，在37℃下長勢良好。分離得到的菌落中，細菌菌落表現(xiàn)為黃的小菌落，直徑約為2 mm，其邊緣完整，沒有凸起，表面潮濕。

從這些菌落中選取2株接種至普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)，將其命名為：菌株SP01，于4℃下保存。該致病菌經(jīng)過梅里埃微生物自動鑒定系統(tǒng)鑒定為腦膜炎敗血伊麗莎白金菌。

3.2 單克隆抗體的制備

取菌液濃度為1.0×108CFU/mL的滅活腦膜炎敗血伊麗莎白菌菌液免疫小鼠后，于35 d后取眼血用間接ELISA測量血清效價，結(jié)果呈陽性，可用于加強免疫后進行細胞融合。

融合后3 d，殘余SP2/0骨髓瘤細胞在HAT液中全部死亡，融合后5 d可見雜交瘤細胞呈集落性生長，2周后可見培養(yǎng)孔內(nèi)雜交瘤細胞生長至底孔面積約1/3，上清液開始變黃，腦膜炎伊麗莎白菌的融合率約為55%。

3.3 雜交瘤細胞的篩選抗原特異性檢測結(jié)果

用間接ELISA反應，篩選出3株能分泌腦膜炎伊麗莎白菌抗體的細胞株，命名為1A4，1A6和1F5，對著者株細胞株進行交叉反應篩選，發(fā)現(xiàn)1A4與1F5與遲緩愛德華氏菌存在交叉反應，1A6可分泌腦膜炎伊麗莎白菌的單克隆抗體，與其他常見水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌不存在交叉反應，特異性強，可用于進一步實驗。具體數(shù)據(jù)，如表1所示。

表1 單克隆抗體ELISA特異性檢測結(jié)果

4 討論與總結(jié)

本實驗對患有歪頭病的棘胸蛙各組織進行劃線分離，分離所得細菌菌落形態(tài)均相似，對腦組織分離到的優(yōu)勢細菌進行鑒定，鑒定結(jié)果均為伊麗莎白菌屬細菌中的腦膜炎敗血伊麗莎白菌(E.meningoseptica)。由于未利用此菌株對棘胸蛙進行回歸感染，因而無法判定其是否為棘胸蛙歪頭病的病原菌，但可以明確的是，腦膜炎敗血伊麗莎白菌為此次采集的歪頭病棘胸蛙體內(nèi)的優(yōu)勢菌種，可以透過血腦屏障，感染棘胸蛙腦組織，并影響棘胸蛙其他器官。同時此次試驗所得與張奇亞[4]、雷雪平[10]、何成偉[11]等的實驗相符，腦膜炎敗血伊麗莎白菌為水生動物養(yǎng)殖中歪頭病的常見致病菌。

單克隆抗體在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防范方面起到重大作用，可以對疾病進行診斷[12]、免疫[13]及藥物殘留檢測[14]，通過分子免疫學的手段制備單克隆抗體，可以減少水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的消耗，為水生動物疾病的預防、檢測、治療提供新的手段。本次研究制備了棘胸蛙腦膜炎敗血伊麗莎白菌的單克隆抗體，單克隆抗體制備技術(shù)具有高度持續(xù)性，實驗包括了眾多的細胞培養(yǎng)和篩選，生物化學檢測分析等實驗，而抗體的特異性是抗體應用價值的關(guān)鍵。本次研究主要就是為了篩選出特異性高活性的腦膜炎敗血伊麗莎白金菌單克隆抗體。

本次實驗從患歪頭病棘胸蛙上分離得菌株SP01，結(jié)合梅里埃微生物自動鑒定系統(tǒng)，證明該細菌為腦膜炎敗血伊麗莎白金菌。為了對該病原菌進行快速準確的早期診斷，本次實驗制備了抗棘胸蛙腦膜炎敗血伊麗莎白金菌單克隆抗體，用間接ELISA法進行檢測，結(jié)果顯示實驗獲得雜交瘤細胞株1A6具有較好的抗體活性，與其他常見致病菌無交叉反應，特異性良好，能夠為后期制作免疫膠體金及免疫組織化學觀察等提供前期基礎(chǔ)性研究，有利于為棘胸蛙人工養(yǎng)殖業(yè)提供技術(shù)支撐，具有較好的經(jīng)濟、社會與生態(tài)效益。