春小麥脂肪氧化酶TaLox-B位點等位變異檢測及分布規(guī)律

董一帆 嚴勇亮 謝 磊 庫尼都孜阿依·吐爾汗 戰(zhàn)帥帥 耿洪偉*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)作物品種資源研究所，烏魯木齊 830091)

我國消費者的飲食習慣多以面制品為主，對于面粉色澤要求較高。面粉的色澤與其制品的商品質(zhì)量密切相關(guān)，是衡量小麥品質(zhì)的重要指標之一[1]。因此對面粉及其制品色澤的研究是小麥品質(zhì)遺傳改良的重要內(nèi)容。面粉的白度在很大程度上受小麥籽粒中脂肪氧化酶(lipoxygenase, 簡稱LOX)活性高低的影響[2-3]。小麥籽粒中LOX能通過偶聯(lián)氧化小麥面粉中的類胡蘿卜素，進而使面粉色澤變白，起到漂白的效果[4]。同時，小麥籽粒中LOX的活性高低還能影響小麥籽粒儲藏期長短和面筋強度等特性[2,5-7]，由于低LOX活性顯著減緩脂質(zhì)降解，因此使小麥籽粒氧化變質(zhì)時間得以推遲，從而有助于延長小麥籽粒的儲藏期[6]。高LOX活性在LOX催化反應過程中能將更多蛋白質(zhì)分子中的巰基(-SH)氧化為二硫鍵(-S-S)，因此蛋白質(zhì)分子能夠高度聚合，防止面筋蛋白水解，從而有助于增強面筋強度[5,7]。

LOX蛋白家族，是含非血紅素鐵的一類蛋白質(zhì)，屬于多元不飽和脂類的酶系，在自然界中普遍存在[8-9]，參與植物的生長發(fā)育和一些抵御逆境脅迫的生理過程。目前，對小麥LOX已有大量的研究報道，研究表明環(huán)境和基因型對LOX活性均有影響，但其活性主要受基因型影響[10-11]。Geng等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)小麥4BS染色體上的TaLox-B1位點是LOX活性的主效基因，并基于此位點基因的序列多態(tài)性開發(fā)了互補的顯性功能標記LOX16和LOX18，可用于區(qū)分TaLox-B1位點上的等位變異TaLox-B1a和TaLox-B1b。用LOX16標記對材料進行擴增，可以得到489 bp的片段，表明材料含有優(yōu)異等位變異TaLox-B1a類型，用LOX18標記對材料進行擴增，可以得到791 bp的片段，表明材料含有等位變異TaLox-B1b類型。楊杰等[14]和相吉山等[15]用LOX16和LOX18標記分別對寧夏回族自治區(qū)180份和新疆維吾爾自治區(qū)195份小麥種質(zhì)資源進行標記檢測，發(fā)現(xiàn)該標記能在供試材料中清晰且穩(wěn)定地擴增出489和791 bp的條帶，能夠準確鑒定出材料的TaLox-B1a和TaLox-B1b基因類型。隨后Zhang等[16]利用同源克隆技術(shù)在小麥4BS染色體上克隆出TaLox-B2和TaLox-B3基因，并基于TaLox-B2和TaLox-B3基因開發(fā)了共顯性標記LOX-B23。利用標記LOX-B23對材料進行擴增，若同時擴增出788和677 bp的片段，則該材料為等位變異TaLox-B2a和TaLox-B3a類型；只能擴增出788 bp的單一片段，則該材料為TaLox-B2a和TaLox-B3b等位變異；只能擴增出660 bp的單一片段，則該材料為等位變異TaLox-B2b和TaLox-B3b類型。LOX-B23標記能有效區(qū)分TaLox-B2和TaLox-B3基因位點上的不同等位變異，可應用于小麥LOX基因活性的篩選。Zhang等[16]利用LOX16、LOX18和LOX-B23等標記對我國小麥種質(zhì)資源進行了TaLox-B位點等位變異檢測和LOX活性的分析，結(jié)果表明在TaLox-B位點的等位變異基因組合中TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a或TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a，TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b或TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1a/TaLox-B2b/TaLox-B3b，分別與LOX高、中等和低活性顯著正相關(guān)。白璐等[17]研究表明等位變異基因組合TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b與高LOX活性負相關(guān)。

雖然目前利用與LOX活性相關(guān)的功能標記LOX16、LOX18和LOX-B23對新疆小麥種質(zhì)資源TaLox-B位點的等位基因分布已有報道[15,17]，但研究的小麥類型多為冬小麥。目前對國內(nèi)外春小麥種質(zhì)資源中TaLox-B位點等位基因分布特征的研究鮮有報道。本研究利用LOX16、LOX18和 LOX-B23 等功能標記對237份國內(nèi)外春小麥品種(系)的TaLox-B位點進行檢測，旨在分析脂肪氧化酶TaLox-B位點等位基因在國內(nèi)外不同地區(qū)春小麥種質(zhì)資源中的分布規(guī)律，以期為春小麥面粉色澤遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試237份春小麥品種(系)由新疆農(nóng)科院農(nóng)作物品種資源研究所嚴勇亮研究員課題組提供，其中國內(nèi)新疆春小麥地方品種(系)154份，國外春小麥品種(系)83份。新疆春小麥生態(tài)類型多樣，一般分為南疆、北疆、東疆和伊犁河谷等4個生態(tài)區(qū)。新疆154份春小麥地方品種(系)來自新疆的北疆95份、南疆31份、東疆20份和伊犁河谷8份；國外春小麥品種(系)來自于亞洲其他國家8份、歐洲33份、美洲29份、非洲7份和大洋洲6份。

1.2 基因組DNA提取

每個小麥品種(系)均取3粒完整且大小均勻的籽粒，粉碎后置于2.0 mL的離心管中，按照SDS方法[18]提取DNA。

1.3 PCR擴增及檢測

利用Geng等[13]和Zhang等[16]開發(fā)的功能標記LOX16、LOX18和LOX-B23，檢測小麥4B染色體上TaLox-B位點的等位變異。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，見表1。

以小麥基因組DNA為模板，在Eppendorf AG PCR儀(Eppendorf，德國)上進行PCR擴增。15 μL 的PCR反應體系：以1.0 μL的DNA為模板，2×Es Taq MasterMix(Dye)7.5 μL(北京康為世紀生物科技有限公司)，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，用ddH2O補充至15.0 μL。按照白璐等[17]LOX16、LOX18和LOX-B23標記的擴增程序進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，ddH2O漂洗后用VILBER LOURMAT凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。

表1 檢測LOX的 TaLox-B位點等位變異的標記信息Table 1 Marker′s information of allelic variation at TaLox-B locus of LOX was detected

1.4 統(tǒng)計方法

選取符合目的條帶大小、條帶清晰且無雜帶的PCR產(chǎn)物，進行統(tǒng)計，根據(jù)此結(jié)果判斷該品種的TaLox-B位點等位基因的變異類型。若某一品種(系)的3粒籽粒PCR產(chǎn)物條帶大小不一致，則需重新提取該品種(系)的DNA，重新進行PCR檢測，以3次結(jié)果一致為準。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaLox-B位點等位基因變異類型及分布頻率

由圖1可知，所選國內(nèi)和國外材料在TaLox-B1位點上，TaLox-B1b變異類型的分布頻率分別為95.5%和85.5%，遠高于優(yōu)異等位變異類型TaLox-B1a(與高LOX活性極顯著正相關(guān))的頻率(平均8.0%)，因此在TaLox-B1位點上，優(yōu)勢等位變異(分布頻率較高的等位變異類型)均為與低LOX活性相關(guān)的TaLox-B1b變異類型，說明國內(nèi)外材料具有優(yōu)異等位變異TaLox-B1a的分布頻率均很低。但國外材料具有的優(yōu)異等位變異TaLox-B1a的頻率(14.5%)遠高于國內(nèi)材料(4.5%)，說明國外春小麥品種(系)具有的高LOX活性基因TaLox-B1a的分布頻率遠高于國內(nèi)新疆春小麥地方品種(系)。國內(nèi)外供試小麥材料在TaLox-B2和TaLox-B3位點，TaLox-B2a和TaLox-B3a變異類型的分布頻率分別為93.2%和86.1%，為優(yōu)勢等位變異，其中，國內(nèi)材料的優(yōu)異等位變異TaLox-B2a和TaLox-B3a的分布頻率均高于國外材料。

圖1 春小麥的TaLox-B位點等位基因的分布頻率Fig.1 Distribution frequency of TaLox-B locus alleles in spring wheat

2.2 新疆不同生態(tài)區(qū)的春小麥TaLox-B位點等位基因的分布及其組合類型頻率

對154份新疆不同生態(tài)區(qū)的春小麥TaLox-B位點進行等位變異檢測結(jié)果表明，在TaLox-B1位點，優(yōu)異等位變異類型TaLox-B1a的材料7份(4.5%)。在TaLox-B2和TaLox-B3位點，優(yōu)異等位變異類型TaLox-B2a和TaLox-B3a的材料分別有147(95.5%)和141份(91.6%)。優(yōu)異等位變異TaLox-B1a的分布頻率表現(xiàn)為北疆地區(qū)(6.3%)>南疆地區(qū)(3.2%)>整體水平(4.5%)；優(yōu)異等位變異TaLox-B2a在伊犁河谷、南疆、北疆和東疆地區(qū)逐次升高(分布頻率依次為：75.0%、93.5%、96.8%和100.0%)，優(yōu)異等位變異TaLox-B3a在伊犁河谷、北疆、南疆和東疆地區(qū)逐次升高，分布頻率依次為：75.0%、90.5%、93.5%和100.0%，見圖2。

154份新疆不同生態(tài)區(qū)的春小麥地方品種(系)共檢測出5種基因型組合，TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b，其頻率分別為3.9%、87.7%、3.2%、0.6%和4.6%。新疆不同生態(tài)區(qū)的春小麥地方品種(系)具有的最高LOX活性基因型組合TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a在伊犁河谷、北疆、南疆和東疆地區(qū)逐次升高，分布頻率之和依次為75.0%、90.6%、93.5%和100.0%，見圖3。其中20份東疆地區(qū)材料均檢測為高LOX活性基因型組合TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a。

2.3 國外春小麥TaLox-B位點等位基因的分布及其組合類型頻率

由圖4可知，比較83份國外春小麥品種(系)的TaLox-B1位點，大洋洲地區(qū)(主要來自澳大利亞)的材料均為與低LOX活性相關(guān)的等位變異類型TaLox-B1b，而優(yōu)異等位變異TaLox-B1a分布頻率在亞洲、美洲、非洲和歐洲地區(qū)中依次升高。在TaLox-B2位點，大洋洲地區(qū)的材料均為優(yōu)異等位變異TaLox-B2a。在TaLox-B3位點，美洲地區(qū)的材料具有優(yōu)異等位變異TaLox-B3a的頻率(82.8%)高于其他地區(qū)(75.9%)。

在83份國外材料中，5種基因型組合TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b的頻率分別為12.1%、63.9%、10.8%、2.4%和10.8%，見圖5。供試的國外春小麥品種(系)具有的高LOX活性基因型組合TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a在大洋洲、非洲、亞洲、歐洲和美洲地區(qū)的分布頻率之和依次為50.0%、71.4%、75.0%、75.8%和82.8%。

2.4 國內(nèi)外春小麥TaLox-B位點等位變異基因組合頻率

在237份國內(nèi)外春小麥品種(系)中，共檢測出5種基因型組合：TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a、TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3b、TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3b和TaLox-B1b/TaLox-B2b/TaLox-B3b，其頻率分別為6.8%、79.3%、5.9%、1.3%和6.7%，見圖6。國內(nèi)外供試品種(系)的優(yōu)勢等位變異基因組合(分布頻率較高的等位變異基因組合)為TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a，是與高LOX活性顯著正相關(guān)的優(yōu)異等位變異基因組合。供試品種(系)中新疆春小麥地方品種(系)所具有的優(yōu)異等位變異基因組合TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a和TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a的頻率之和為91.6%高于國外春小麥品種(系)(76.0%)，但國外春小麥品種(系)具有高LOX活性基因組合TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a頻率(12.1%)遠高于國內(nèi)新疆春小麥地方品種(系)(3.9%)。

3 討 論

3.1 功能標記的應用價值

功能標記是基于控制表型性狀功能基因內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)核苷酸序列多態(tài)性位點而開發(fā)的分子標記[19]，直接反映作物的表型性狀，具有便捷、穩(wěn)定和高效等特點。利用功能標記輔助選擇育種能夠提高育種效率，縮短育種時間。目前，已大量開發(fā)出與品質(zhì)、產(chǎn)量和抗逆等重要性狀有關(guān)的功能標記，并廣泛應用于育種實踐中[20-22]，已成為小麥等主要農(nóng)作物分子育種的重要手段[23]。

功能標記能夠準確而快速地檢測小麥種質(zhì)資源所攜帶的等位基因，提高了育種工作者對小麥特定性狀的選擇效率，進而加速育種進程。產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性多為復雜的數(shù)量性狀，多個相關(guān)基因的功能標記能對某一性狀的選擇更加有效，也能提高功能標記的應用價值和分子標記輔助選擇的作用。因此，應加大功能標記開發(fā)和利用，在針對小麥某一性狀時，結(jié)合其多個功能標記進行檢測，更能準確快速地對小麥種質(zhì)資源進行篩選，從而提高育種進程。

3.2 小麥LOX的TaLox-B基因的等位變異分布規(guī)律

已有研究表明，在TaLox-B1位點，優(yōu)異等位變異TaLox-B1a的頻率遠低于TaLox-B1b[14-15,17,11,24-25]；在TaLox-B2和TaLox-B3位點，與高LOX活性相關(guān)的優(yōu)異等位變異TaLox-B2a和TaLox-B3a均為優(yōu)勢等位變異[17]。本研究利用LOX16、LOX18和LOX-B23等功能標記對237份國內(nèi)外春小麥品種(系)進行檢測，結(jié)果表明，不同TaLox-B位點的等位變異分布與已有的報道[14-15,17,11,24-25]基本一致。新疆不同生態(tài)區(qū)春小麥地方品種資源中，北疆生態(tài)區(qū)材料具有高LOX活性TaLox-B1a的基因型頻率(6.30%)高于相吉山等[15]研究的新疆春小麥地方品種資源的基因型頻率(4.55%)。這可能與相吉山等[15]研究所用的供試春小麥品種數(shù)量較少和代表性不強有關(guān)，也可能與北疆生態(tài)區(qū)位于新疆北部較發(fā)達地區(qū)有關(guān)，相較于新疆其他地區(qū)而言，育種工作者對小麥色澤品質(zhì)性狀重視度較高和研究起步較早有關(guān)。

在不同小麥類型(冬小麥和春小麥)中，TaLox-B1、TaLox-B2和TaLox-B3位點上，冬小麥具有的與高LOX活性相關(guān)的TaLox-B1a、TaLox-B2a和TaLox-B3a優(yōu)異等位變異分布頻率均高于春小麥[15,17,24]。由此可見，春小麥的色澤品質(zhì)相比之冬小麥較差，因此在未來的育種過程中應加大對春小麥的色澤改良力度，以期提高春小麥的色澤品質(zhì)。

圖6 國內(nèi)外春小麥TaLox-B位點等位基因組合類型的分布頻率Fig.6 Distribution frequencies of allele combinations at TaLox-B loci in spring wheat at domestic and abroad

3.3 不同來源的小麥LOX分布規(guī)律

本研究利用功能標記LOX16和LOX18對237份國內(nèi)外春小麥品種(系)進行分子標記檢測，結(jié)果表明，供試品種(系)中的新疆春小麥地方品種(系)的TaLox-B1a基因型分布頻率遠低于國外春小麥品種(系)，這表明新疆春小麥地方品種(系)具有的與高LOX活性相關(guān)的優(yōu)異等位變異TaLox-B1a分布頻率遠低于國外水平。即新疆春小麥地方品種在色澤品質(zhì)方面與國外春小麥品種仍有較大差距。這可能與新疆早期小麥育種目標多以高產(chǎn)為主[26]，對小麥色澤品質(zhì)改良的關(guān)注較少有關(guān)。因此未來可通過引進國外優(yōu)良品種和加大地方品種選育等方式縮小與國外良種的差距。

白璐等[17]利用LOX16、LOX18和LOX-B23等標記對24份新疆春小麥自育品種進行檢測，結(jié)果顯示新疆春小麥自育品種具有的最高LOX活性基因型組合TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a的頻率僅為16.7%。本研究利用上述功能標記對154份新疆春小麥地方品種(系)進行檢測，結(jié)果表明，新疆春小麥地方品種(系)所含有的高LOX活性的基因型組合TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a頻率為87.7%，遠高于白璐等[17]研究結(jié)果。劉三才等[27]的研究結(jié)果表明，我國的小麥品種選育的遺傳多樣性和品質(zhì)性狀的變異性與我國地方品種相比有所下降。雖然自育品種多為地方品種經(jīng)多代單株自交系統(tǒng)選育的純合系，但新疆春小麥自育品種在選育的過程中面粉白度較高的品種未被選育保留下來。因此，未來應加大對新疆春小麥地方品種的開發(fā)利用。

本研究發(fā)現(xiàn)，新疆不同生態(tài)區(qū)中，東疆地區(qū)的材料均檢測為含有高LOX活性的TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合，因此，新疆東疆地區(qū)的春小麥地方品種(系)是新疆不同生態(tài)區(qū)中選育高LOX活性小麥的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源。供試的國外不同地區(qū)春小麥品種(系)中，美洲地區(qū)春小麥材料所具有的高LOX活性的TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a或TaLox-B1b/TaLox-B2a/TaLox-B3a基因型組合的頻率最高，這可能與美洲地區(qū)小麥育種家對小麥色澤品質(zhì)性狀研究起步較早有關(guān)。因此在對國外優(yōu)良品種的引進時可傾向于美洲地區(qū)的良種。

4 結(jié) 論

本研究利用分子標記檢測，從237份國內(nèi)外春小麥品種(系)中，篩選出16份材料具有高LOX活性基因型組合(TaLox-B1a/TaLox-B2a/TaLox-B3a)，可作為新疆地區(qū)選育高白度面粉的春小麥種質(zhì)材料，其中10份國外春小麥品種包括‘Kartner Fruhweizen’、‘Kenhi 13627’、‘RL 2327’、‘Super Helyis’、‘Supremo 211’、‘Swedish 880D’、‘White Fife’、‘Brevrt W 972’、‘Kitchener’和‘荷蘭小麥’，6份為新疆春小麥地方品種(系)包括‘白春麥 (CM026)’、‘白春麥(CM121)’、‘阿克牙孜干’、‘奇春4號’、‘奇春5號’和‘黑穗紅芒’。