宿主細胞殘留D N A 片段大小分布檢測方法的建立及驗證

閆璐瑤，張家友，張青梅，張哲罡，夏志武，邱冉，劉京，楊曉明

1.武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究二室，湖北武漢430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢430207；3.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京100029

宿主細胞殘留DNA 是指可能出現(xiàn)于生物制品中的來自宿主組織細胞的DNA 片段或更長的分子，其可能存在于最終的產(chǎn)品中［1］。目前，許多生物制品以細胞為生產(chǎn)基質(zhì)，宿主細胞殘留DNA 給病毒疫苗等連續(xù)細胞系衍生的生物制品造成了潛在的安全風險。相關(guān)的風險主要為感染性和致癌性，如存在逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，其基因整合入受試者基因組則可能導致感染；病毒或傳代細胞基質(zhì)的致癌基因則有可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風險［2-4］。

國內(nèi)外各類監(jiān)管機構(gòu)出臺了生物制品中可接受的宿主細胞殘留DNA 水平的指導方針，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）要求生物制品終產(chǎn)品中宿主細胞DNA 殘留量不得超過10 ng ／ 劑量［5］，美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定宿主細胞殘留DNA 不高于100 pg ／ 劑量、長度不大于300 bp［6］，《中國藥典》三部（2020 版）中規(guī)定宿主細胞殘留DNA 不高于50 pg ／ 劑量［7］?？紤]到細胞基質(zhì)的特性和生物制品的用途等因素，DNA 殘留量應控制在更低水平，除了殘留DNA 的數(shù)量外，大小分布也是確定其相關(guān)危險因素的重要指標。

各國藥典陸續(xù)提供了數(shù)種關(guān)于宿主細胞殘留DNA 定量檢測的經(jīng)典方法，包括閾值法、雜交法、熒光染色法及實時熒光定量PCR 法，但均未對殘留DNA 片段大小的檢測方法給出明確指導。一般認為，DNA 片段在300 bp 以上可整合至受試者基因組，編碼有功能的蛋白，增加了殘留DNA 的風險［8］。因此，為優(yōu)化疫苗質(zhì)量控制，本研究基于高靈敏的微型化芯片電泳法，建立了一種操作簡便、結(jié)果直觀、檢測靈敏、具有良好精密度的宿主細胞DNA 殘留片段大小分布的檢測方法，并對MDCK（Madin-Darby canine kidney）細胞基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)過程中間品進行檢測，有望用于連續(xù)細胞系衍生生物制品的原液檢定和質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 供試品 MDCK 細胞基質(zhì)四價流感疫苗生產(chǎn)中間品：H1N1 型流感病毒收獲液、病毒微濾液、核酸酶處理收獲液、濃縮病毒液、層析病毒液，批號：202006Z002H1，由武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究二室提供。

1.2 細胞 MDCK 細胞購自ATCC（美國標準菌種保藏中心），編號CCL-34，由武漢生物制品研究所病毒性疫苗研究二室保存。

1.3 主要試劑及儀器 磁珠法動物基因組DNA 提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；樣品殘留DNA 提取試劑盒購自湖州申科生物技術(shù)有限公司；Agilent 2100 生物分析系統(tǒng)及高靈敏度DNA 試劑盒購自美國Agilent 科技有限公司；Microdrop 紫外可見分光光度計購自上海寶予德科學儀器有限公司。

1.4 M D C K 細胞基因組提取 采用磁珠法動物基因組DNA 提取試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行。取10 mL 貼壁細胞消化液于15 mL 離心管中，離心棄上清，加入抽提緩沖液和Proteinase K，65 ℃水浴30 min；15 294 ×g離心10 min，取上清至新的1.5 mL 離心管中，加入20 μL RNase A（10 mg／mL），加入結(jié)合液和磁珠，分離磁珠；棄上清，加入700 μL 70%乙醇，分離磁珠；棄上清，洗滌1 次，將離心管開蓋干燥20 min，去殘留乙醇；加入100 μL TE Buffer，65 ℃水浴10 min；分離磁珠，上清即為細胞基因組。抽提樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計鑒定濃度和純度。

1.5 樣品殘留D N A 提取 采用樣品殘留DNA 提取試劑盒，具體操作按試劑盒說明書進行。取100 μL供試品，加入蛋白酶K 溶液，混勻后55 ℃水浴1 h，使膜蛋白降解、與DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)降解、DNA 充分游離；加入200 μL 異丙醇和10 μL 磁珠，使游離DNA 與磁珠充分結(jié)合，分離磁珠；加入各700 μL 洗滌液A 和B，使磁珠和洗滌液混勻，完成2 次磁珠洗滌；將離心管開蓋干燥10 min，除去殘留乙醇；加入100 μL 預熱洗脫液，混勻后70 ℃水浴10 min，分離磁珠；上清即為DNA 純化液，經(jīng)紫外可見分光光度計測定濃度和純度。

1.6 方法的建立 準備底盤在C 位置，調(diào)整注射器卡夾在最低位置。準備凝膠染料混合物：將DNA 染料（藍色）和凝膠（紅色）室溫平衡30 min；將15 μL DNA 染料加入凝膠中，充分混勻并離心，轉(zhuǎn)移至離心過濾管，2 240 ×g離心15 min；混合物需在6 周內(nèi)使用完畢。凝膠注入：將一張新的芯片放在芯片槽內(nèi)，在第1 孔注入9 μL 凝膠染料混合物，確保注射器推桿在1 mL 位置，蓋上注膠平臺蓋子，勻速按壓注射器推桿直至固定架卡扣卡住，等待60 s 松開卡扣，等待5 s 注射器推桿穩(wěn)定后，將其緩慢拉回至1 mL 刻度，分別在2、3、4 孔加入9 μL 凝膠染料混合物，5 ～ 16 孔分別加入5 μL marker（綠色）；在第5 孔加入1 μL 高靈敏度DNA ladder（黃色），第6 ～ 16 孔加入1 μL 準備好的樣品；將芯片放入水平適配振蕩器中，612 ×g振蕩1 min；將芯片放入儀器開始運行。

1.7 方法的驗證

1.7.1 檢測范圍 使用高靈敏度DNA 試劑盒中包含35 和10 380 bp 的2 個marker 和包含50、100、150、200、300、400、500、600、700、1 000、2 000、3 000和7 000 bp 的13 個等質(zhì)量DNA 片段的ladder，檢測系統(tǒng)的性能，并確定各峰遷移時間。

1.7.2 精密度 取H1N1 型流感病毒濃縮液樣品，按1.5 項方法抽提樣品宿主細胞殘留DNA，平行設3 份樣品，同一樣品由3 名實驗員按1.6 項方法分析殘留DNA 的片段大小分布，且同一名實驗員對同一樣品連續(xù)檢測3 次，計算300 bp 以下片段占總外源DNA 的比例，并計算CV。

1.8 方法的初步應用 取H1N1 型流感病毒收獲液、病毒微濾液、核酸酶處理收獲液、濃縮病毒液、層析病毒液樣品，按照1.5 項方法提取宿主細胞殘留DNA，按照1.6 項方法分析殘留DNA 的片段大小分布。

2 結(jié) 果

2.1 M D C K 細胞基因組的鑒定 抽提的細胞基因組DNA 濃度為933.06 ng ／ μL，A260／280值為2.079，濃度和純度均較高。1%瓊脂糖凝膠電泳DNA 顯示有1 條清晰條帶，大量彌散條帶，符合全基因組DNA 電泳特征，可作為陽性對照，見圖1；芯片電泳顯示有連續(xù)分布的核酸片段，瓊脂糖凝膠電泳模擬圖與實驗室電泳圖顯示結(jié)果一致，均有大量彌散條帶，見圖2。

2.2 方法的驗證

2.2.1 檢測范圍 高靈敏度DNA ladder 可檢測35～10 380 bp 的條帶；35 bp DNA 含量為125 pg ／ μL，10 380 bp DNA 含量為75 pg ／ μL，其余l(xiāng)adder 條帶DNA 含量均為150 pg ／ μL。見圖3。

圖1 MDCK 細胞基因組瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel chromatographic profile of genome of MDCK cells

圖2 芯片電泳圖及模擬瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Chip and mimic agarose gel chromatographic profiles

圖3 DNA ladder 芯片電泳圖Fig.3 Electrophoretic profile of DNA ladder

2.2.2 精密度 3 名實驗員對相應樣品重復檢測3次，300 bp 以下片段所占百分比檢測結(jié)果的CV分別為1.46%、3.35%和4.00%，不同實驗員間檢測結(jié)果的CV分別為2.91%、1.94%和4.33%，見表1，表明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度驗證結(jié)果（%）Tab.1 Verification for precision（%）

2.3 方法的應用 病毒收獲液及病毒微濾液外源DNA片段較大，經(jīng)核酸酶處理后，大部分殘留DNA小于300 bp，所有殘留DNA 平均大小約100 bp，且層析病毒液300 bp 以下片段占總外源DNA 的84%，見圖4 和表2。

表2 殘留DNA 片段大小分布比例（%）Tab.2 Size distribution proportions of residual DNA fragments（%）

圖4 H1N1 病毒收獲液（A）、病毒微濾液（B）、核酸酶處理收獲液（C）、濃縮病毒液（D）、層析病毒液（E）樣品芯片電泳圖及模擬瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Chip electrophoretic profile and mimic agarose gel electrophoretic profile of harvest of influenza H1N1 virus（A），microfiltration fluid of virus（B），virus digested with nuclease（C），concentrated virus（D）and the virus purified by chromatography（E）

3 討 論

目前市場上各種細胞系衍生生物制品越來越多，細胞系的種類、代次、生長特性等直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量，尤其是產(chǎn)品的安全性［9］。其中，宿主細胞殘留DNA 被國內(nèi)外監(jiān)管機構(gòu)關(guān)注，在病毒性疫苗中，外源DNA 盡管有著相同的雙螺旋結(jié)構(gòu)，但其片段長度不同，以不同的物理形式存在，可能將激活的癌基因或具有傳染性的病毒基因組傳遞給疫苗接種者［10-11］。因此，為監(jiān)測疫苗生產(chǎn)過程中宿主細胞殘留DNA 的量和片段大小分布，需要建立一個準確、靈敏的方法。

毛細管電泳是粒子在高壓電場驅(qū)動下，在毛細管中按其滴度或分配系數(shù)，進行高效、快速分離的一種電泳技術(shù)。當配置有激光誘導熒光模塊時，可靈敏分析低濃度和小體積的核酸。本研究根據(jù)高靈敏度的芯片法毛細管電泳技術(shù)，建立了宿主細胞殘留DNA 片段分布檢測的方法，并對該方法的檢測范圍、精密度進行了驗證。結(jié)果表明，該方法可明確分析35 ～ 10 380 bp 之內(nèi)的片段分布，對于區(qū)間外的片段，也可給出一個片段大小預測供參考；精密度驗證各次檢測CV均小于10%，表明該方法具有良好的精密度。同時，該方法可根據(jù)已知的DNA ladder給出片段的相對含量，并計算各片段分布的占比，直觀地反映了樣品中殘留DNA 的情況，為監(jiān)測疫苗生產(chǎn)流程提供了依據(jù)。

與傳統(tǒng)的雞胚基質(zhì)流感疫苗相比，細胞基質(zhì)流感疫苗具有更標準化和成熟的制備技術(shù)，更容易大規(guī)模生產(chǎn)，并且在細胞中復制的病毒可能更適應人體［12］。也有數(shù)據(jù)證實，細胞基質(zhì)流感疫苗安全性和免疫原性更好［13］。新的細胞基質(zhì)存在新的挑戰(zhàn)及風險，MDCK 細胞是一種犬腎細胞，具有無限傳代的能力，因此其致瘤性和成瘤性問題備受關(guān)注。MDCK細胞基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)工藝（包括超濾、核酸酶處理、層析、β-丙內(nèi)酯滅活等）過程中，大量宿主細胞殘留DNA 已被去除，且大多已斷裂成300 bp 以下的DNA 片段［14］。本研究應用該方法對H1N1 型流感疫苗生產(chǎn)中間品進行宿主細胞殘留DNA 片段大小分布檢測，結(jié)果表明，病毒收獲液及病毒微濾液外源DNA 片段較大，經(jīng)核酸酶處理可將大片段的殘留DNA 酶解為小于300 bp 的片段，且層析病毒液中300 bp 以下的片段占總外源DNA 的84%，后續(xù)純化步驟也可進一步去除外源DNA。

綜上所述，本實驗建立的芯片法毛細管電泳精密度良好，通過分析外源DNA 片段大小分布情況，可監(jiān)控細胞基質(zhì)流感疫苗生產(chǎn)過程，為生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供依據(jù)，為質(zhì)量控制提供支持，同時也可能為其他細胞系衍生疫苗的生產(chǎn)工藝提供依據(jù)。