多囊卵巢綜合征中高雄激素誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞自噬激活作用

孫東梅，柴蔚然，匡延平，王鋒

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 太原030000；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科，上海200011

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女常見多方面紊亂的內(nèi)分泌代謝異常疾病，具體病理過程尚未完全了解。PCOS 的病因主要包括遺傳參數(shù)、表觀遺傳缺陷及環(huán)境因素。依據(jù)“PCOS鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)”，PCOS 已影響6% ～15%的育齡女性［1］，該類不孕患者占排卵障礙性不孕患者的50% ～70%［2］。PCOS 患者除有高雄激素、慢性不排卵及多囊卵巢的主要癥狀外，還常伴有胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂、能量代謝紊亂、肥胖、慢性低度炎癥、內(nèi)皮功能障礙及心血管疾病等［3-5］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

有文章報道，自噬在PCOS 卵巢組織中被激活［6］。且自噬在PCOS 相關(guān)代謝紊亂中的作用日益被重視［7-8］。小泛素樣修飾物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）化修飾是多種細(xì)胞類型中重要的翻譯后蛋白修飾，與自噬激活有關(guān)［9］。SUMO 特異肽酶3（SUMO specific peptidase 3，SENP3）是Sentrin ／ sumo特異性蛋白酶（SENPs）家族成員之一，能從蛋白中去除SUMO2 ／ 3，其表達(dá)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，而PCOS 患者中的高雄激素血癥也可引起卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)［10］。

本研究通過檢測PCOS 患者與正常卵巢功能的不孕患者原代卵巢顆粒細(xì)胞自噬激活程度，探討PCOS 患者中高雄激素血癥與顆粒細(xì)胞自噬的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 卵巢功能正常的不孕患者（對照組）和PCOS 不孕患者（PCOS 組）各30 例，于2018 年3—10 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科行控制性超排卵研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡20 ～38 歲；身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）18 ～24 kg ／ m2；卵巢功能正常，即月經(jīng)周期在25 ～35 d，基礎(chǔ)水平的促卵泡生成素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）正常，竇狀卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC）大于5，抗苗勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）正常；PCOS 患者的睪酮（testosterone）水平均高于0.7 nmol ／ L。排除標(biāo)準(zhǔn)：子宮內(nèi)膜病變?nèi)缱訉m內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎、宮腔黏連、子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜異位癥等；近3 個月服用激素類藥物及減肥藥等；反復(fù)流產(chǎn)、染色體異常等；PCOS 患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)按2003 年“PCOS 鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)”執(zhí)行［11］，排除其他原因引起的排卵障礙性疾病，如卵巢早衰、高泌乳素血癥及甲狀腺功能異常等。兩組患者均選擇孕激素下促排卵方案（progestinprimed ovarian stimulation，PPOS）進(jìn)行控制性超排卵。所有入選患者均已簽知情同意書，本研究方案獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞及質(zhì)粒 人卵巢顆粒細(xì)胞株KGN 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科惠贈；SENP3 質(zhì)粒由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)分子實驗室惠贈。

1.3 主要試劑及儀器 睪酮購自美國Sigma 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green 熒光染料購自寶生物工程（大連）有限公司；RT-PCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LipofectamineTM2000、Trizol裂解液、澳洲胎牛血清及雙抗（青鏈霉素）購自美國Invitrogen 公司；PVDF 膜購自美國Milipore 公司；DMEM ／ F12 及Opti-MEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；人淋巴細(xì)胞分離液、RIPA 裂解液及紅細(xì)胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；LC3Ⅱ／Ⅰ多克隆抗體（2775）、SENP3 抗體（5591S）購自美國CST 公司；β-actin 抗體（60008-1-lg）及羊抗小鼠IgG1（00011）購自美國Proteintech 公司；P62 抗體（ab-56416）購自英國Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo 公司；si-SENP3 基因序列由廣州銳博生物有限公司提供（上游：5′-GGGCUGGAAAGGUUACUUCAADTDT-3′，下游：5′-UUGAAGUAACCUUUCCAGCCCDTDT-3′）；實時熒光定量PCR 儀購自美國Applied biosystems 公司；Imagequant LAS-4000mini 電泳圖像掃描儀購自美國GE 公司；羊抗兔IgG1（31460）及Nanodrop 紫外分光光度計購自美國賽默飛公司。

1.4 卵巢顆粒細(xì)胞的分離 分別收集PCOS 及對照組患者卵泡液，室溫800 ×g離心5 min，棄上清；用3 ～5 mL PBS 重懸沉淀，于新15 mL 離心管中加入等體積的人淋巴細(xì)胞分離液，在上層緩緩加入PBS，保證液平面的完整性；室溫800 ×g離心20 min，至兩液體平面之間出現(xiàn)1 層白色的絮狀物（即卵巢顆粒細(xì)胞）；吸取全部白色絮狀物，加入5 mL PBS 混勻，室溫800 ×g離心5 min，棄上清，重復(fù)2 次；加入約1 mL 紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，冰上裂解5 min，4 ℃，800 ×g離心5 min，棄上清（如紅細(xì)胞裂解不完全可重復(fù)裂解）；PBS 重懸沉淀，4 ℃，800 ×g離心5 min，棄上清，重復(fù)1 次；將1 ～3 份患者的細(xì)胞沉淀混合，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 用2 mL DMEM ／F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗）重懸細(xì)胞，接種6 孔板，于37 ℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)24 h 的PCOS 及對照組卵巢顆粒細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基，PBS 輕輕洗滌細(xì)胞3 次，加入含10 μmol ／ L 睪酮的DMEM ／ F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)檢測。以未處理的PCOS 及對照組卵巢顆粒細(xì)胞為對照。

1.6 卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平的檢測 Western blot法檢測經(jīng)睪酮處理前后PCOS 及對照組卵巢顆粒細(xì)胞中LC3Ⅱ／Ⅰ及P62 蛋白表達(dá)水平。用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白含量，上樣量均為20 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；分別加入LC3Ⅱ／Ⅰ多克隆抗體（1 ∶1 000 稀釋）及P62 抗體（1 ∶2 000稀釋），4 ℃過夜；加入羊抗小鼠IgG1（1 ∶10 000 稀釋），室溫孵育1 h；暗室曝光。

1.7 卵巢顆粒細(xì)胞中SEN P3 基因m R N A 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的檢測

1.7.1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測 采用RTPCR。常規(guī)提取PCOS 及對照組卵巢顆粒細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。SENP3引物序列見表1，引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)按SYBR Green說明書進(jìn)行。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct對目的基因定量分析。

1.7.2 蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Western blot法，按1.6 項檢測，一抗為SENP3 抗體（1 ∶1 000 稀釋），二抗為羊抗兔IgG1（1 ∶10 000 稀釋）。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.8 SEN P3 在自噬激活過程中作用的檢測

1.8.1 KGN 細(xì)胞培養(yǎng) 將KGN 細(xì)胞置10 cm 培養(yǎng)皿中，加入15 mL DMEM ／ F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及1%雙抗），置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d換1 次液。轉(zhuǎn)染前24 h，于2 mL DMEM ／ F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清)中接種3 × 105個細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞融合度約為50%。

1.8.2 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染 用250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋siRNA 至終濃度為50 nmol ／ L；將5 μL LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑加入250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基，輕輕吹打3 ～5 次混勻，室溫靜置5 min；將兩種稀釋液等體積混勻，室溫靜置30 min；轉(zhuǎn)染混合物接種至6 孔板中，80 μL／孔，輕輕搖細(xì)胞板混勻，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染，4 ～6 h 后換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.8.3 質(zhì)粒SENP3 轉(zhuǎn)染 用250 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋5 μL 質(zhì)粒；將siRNA 替換為SENP3 質(zhì)粒，其余操作同1.8.2 項。

1.8.4 KGN 細(xì)胞中LC3Ⅱ／Ⅰ及P62 蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Western blot 法，具體操作步驟同1.6 項。

1.9 睪酮對PC O S 患者顆粒細(xì)胞中SEN P3 蛋白表達(dá)影響的檢測 Western blot 法檢測PCOS 患者顆粒細(xì)胞經(jīng)睪酮處理前后SENP3 蛋白表達(dá)水平，方法同1.7.2 項。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有試驗重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較用t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較用Kruskal-Wallis H檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PC O S 患者卵巢顆粒細(xì)胞自噬水平 結(jié)果顯示，與對照組比較，PCOS 組卵巢顆粒細(xì)胞中LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高（t= 7.31，P＜0.01），P62 蛋白表達(dá)水平顯著降低（t= 5.36，P＜0.01），提示PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞自噬激活。PCOS 組及對照組卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)睪酮處理后，LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著升高（t分別為10.23 和10.65，P分別＜0.05 和＜0.01），P62 蛋白表達(dá)水平顯著降低（t分別為4.90 和3.85，P分別＜0.01 和＜0.05）。見圖1 和圖2。提示卵巢顆粒細(xì)胞在體外經(jīng)睪酮處理后，顆粒細(xì)胞的自噬水平顯著升高。

2.2 SEN P3 在患者卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá) 結(jié)果顯示，與對照組比較，PCOS 組卵巢顆粒細(xì)胞中SENP3基因mRNA 轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平均顯著降低（t分別為30.26 和12.56，P均＜0.05），見圖3 和圖4。

圖1 Western blot 分析患者卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)睪酮處理前后LC3Ⅱ／Ⅰ及P62 蛋白表達(dá)水平Fig.1 Western blotting of expression levels of LC3Ⅱ／Ⅰand P62 in ovarian granulose cells before and after treatment with testosterone

圖2 患者卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)睪酮處理前后P62（A）及LC3Ⅱ／Ⅰ（B）蛋白表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of P62（A）and LC3Ⅱ／Ⅰ（B）in ovarian granulose cells before and after treatment with testosterone

圖3 患者卵巢顆粒細(xì)胞中SENP3 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測Fig.3 Western blotting of expression of SENP3 in ovarian granulose cells

圖4 患者卵巢顆粒細(xì)胞中SENP3 蛋白表達(dá)（A）及基因mRNA 轉(zhuǎn)錄（B）水平Fig.4 Expression levels of SENP3 protein（A）and mRNA（B）in ovarian gra-lnuose cells

2.3 K G N 細(xì)胞中SEN P3 對自噬的作用 KGN 細(xì)胞經(jīng)siRNA 干擾后，SENP3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=7.91，P＜0.01），LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（t= 10.13，P＜0.01），P62 蛋白表達(dá)水平顯著下降（t= 2.90，P= 0.04）；KGN 細(xì)胞經(jīng)SENP3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，SENP3 及P62 蛋白表達(dá)水平顯著升高（t分別為4.28 和4.59，P均＜0.01）；LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平無明顯變化（t= 0.58，P= 0.59）。見圖5 和圖6。提示抑制SENP3 的表達(dá)可促進(jìn)KGN 細(xì)胞的自噬水平，過表達(dá)SENP3 可部分抑制KGN 細(xì)胞的自噬水平，表明SENP3 蛋白表達(dá)的變化可影響KGN 細(xì)胞的自噬水平變化。

2.4 睪酮對PC O S 患者卵巢顆粒細(xì)胞中SEN P3 蛋白表達(dá)水平的影響 PCOS 組卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)睪酮處理后SENP3 蛋白表達(dá)水平顯著下降（t= 3.09，P＜0.05），見圖7 和圖8。表明PCOS 患者體內(nèi)高雄激素可通過抑制SENP3 蛋白表達(dá)激活卵巢顆粒細(xì)胞的自噬。

圖5 KGN 細(xì)胞中SENP3、LC3Ⅱ／Ⅰ及P62 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測Fig.5 Western blotting of expressions of SENP3，LC3Ⅱ／Ⅰand P62 in ovarian granulose cells

圖6 KGN 細(xì)胞中SENP3（A）、LC3Ⅱ／Ⅰ（B）及P62（C）蛋白的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of SENP3（A），LC3Ⅱ／Ⅰ（B）and P62（C）in KGN cells

圖7 PCOS 患者顆粒細(xì)胞中SENP3 蛋白表達(dá)水平的Western blot 檢測Fig.7 Western blotting of expression of SENP3 in ovarian granulose cells of patients with PCOS

圖8 PCOS 患者顆粒細(xì)胞中SENP3 的蛋白表達(dá)水平Fig.8 Expression level of SENP3 in ovarian granulose cells of patients with PCOS

3 討 論

PCOS 患者雄激素分泌失調(diào)可導(dǎo)致功能性卵巢高雄激素血癥（functional ovarian hyperandrogene mia，F(xiàn)OH）。FOH 能引起內(nèi)分泌異常等系列代謝綜合征，月經(jīng)周期紊亂及稀發(fā)排卵或不排卵，直接導(dǎo)致女性不孕。有實驗表明，雄激素可誘導(dǎo)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，在高雄激素誘導(dǎo)的PCOS 大鼠的模型中也發(fā)現(xiàn)了大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡明顯增加［6］。

自噬在PCOS 相關(guān)代謝紊亂中的重要性越來越被重視。如自噬在控制炎癥小體對代謝應(yīng)激反應(yīng)的激活方面具有重要作用［8］。肥胖中自噬基因在人類脂肪組織中上調(diào)，自噬被抑制并與脂肪功能障礙相關(guān)［7］。另外，巨噬細(xì)胞自噬在調(diào)節(jié)肥胖患者的全身胰島素敏感性方面具有重要作用［12］。2 型糖尿病嚴(yán)重胰島素抵抗患者骨骼肌中有幾種自噬標(biāo)志物受到抑制，長期高劑量胰島素可能通過抑制自噬而產(chǎn)生胰島素抵抗的惡性循環(huán)［13］。此外，自噬失調(diào)常與肥胖和糖尿病期間的心肌病及心功能障礙相關(guān)［14］。

近年來，有研究表明，PCOS 患者卵巢組織及顆粒細(xì)胞的自噬有明顯的激活，在PCOS 的大鼠模型中，卵巢組織的自噬激活明顯高于對照組［9］。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，PCOS 患者體內(nèi)卵巢顆粒細(xì)胞自噬被明顯激活，且在高雄激素作用下卵巢顆粒細(xì)胞的自噬激活程度明顯增加，表明PCOS 的FOH 對卵巢顆粒細(xì)胞的激活有一定的作用。

蛋白質(zhì)與SUMO 的共價結(jié)合而影響蛋白質(zhì)功能的過程定義為SUMOylation［15］，這些SUMO 蛋白參與DNA 修復(fù)、自噬及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過程。有研究表明，細(xì)胞SUMOylation 狀態(tài)的平衡在自噬的調(diào)控中起重要作用，其對細(xì)胞生理及生存的影響有正負(fù)兩方面，具體取決于組織類型［16］。SENP3 是SUMO 的特異性蛋白酶，通過對底物去SEMO 化發(fā)揮功能，SENP3 可對p300、p53、PML 等實行去SUMO化［17］，從而影響細(xì)胞的凋亡、增殖及自噬等。本研究中，PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞SENP3 顯著低表達(dá)（P＜0.05），且經(jīng)siRNA 干擾后，KGN 細(xì)胞中LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.01），而P62 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），過表達(dá)SENP3 后，KGN 細(xì)胞中LC3Ⅱ／Ⅰ蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而P62 蛋白表達(dá)水平上升（P＜0.01），表明抑制SENP3 在KGN自噬激活過程中有重要作用，且過表達(dá)SENP3 可能對自噬的下游通路有更明顯抑制作用。為探究雄激素對卵巢顆粒細(xì)胞自噬激活是否可通過影響SENP3的表達(dá)而發(fā)揮作用，用高雄激素睪酮處理PCOS 組及對照組卵巢顆粒細(xì)胞，SENP3 蛋白表達(dá)水平下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示PCOS 患者體內(nèi)睪酮可通過抑制SENP3 的表達(dá)激活卵巢顆粒細(xì)胞的自噬。因此，在PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞上，SENP3 參與了睪酮對細(xì)胞的自噬激活作用。

本實驗存在收集的PCOS 患者顆卵巢粒細(xì)胞樣本量較小，且高雄激素的特征不典型等不足之處，后期還需大量樣本驗證實驗的結(jié)果；SENP3 在高雄激素激活顆粒細(xì)胞的自噬過程中的具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步探究高雄激素血癥對卵巢顆粒細(xì)胞的激活是否會直接影響卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟尚需進(jìn)一步實驗探究。

綜上所述，PCOS 患者卵巢顆粒細(xì)胞有明顯自噬激活，且FOH 可通過抑制SENP3 對卵巢顆粒細(xì)胞的自噬產(chǎn)生激活作用，表明在PCOS 患者的病理生理機(jī)制中，F(xiàn)OH 可能會通過對卵巢組織及顆粒細(xì)胞的自噬激活參與PCOS 患者發(fā)病機(jī)制。本文對研究PCOS 患者發(fā)病機(jī)制提供了一定的參考。