HPLC法測定肝寧片中?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧的含量

姜啟娟，劉炳宏

（1.通化市食品藥品檢驗所，吉林 通化 134001；2.通化市市場監(jiān)督管理局，吉林 通化 134001）

1 儀器與試藥

儀器：高效液相色譜儀（型號：日本島津L C-2010AHT）、電子天平型號（BT25S 感量：0.1/0.01mg 北京賽多利斯儀器天平有限公司）；?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（由中國藥品生物制品檢驗所提供）規(guī)格：供含量測定用；批號： 111689-200501。水為純化水，乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18（4.6×250mm，5μm）；流動相：乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）；流速： 0.8ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：276nm；理論板數(shù)按?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰計算應(yīng)不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品適量，置容量瓶中，加無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，制成每1ml含60μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取約1g ，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液30ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，用無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗滌殘渣與濾紙，合并濾液，低溫蒸干，殘渣用無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

按處方比例配成不含紫草的樣品作為陰性樣品，照2.2.2供試品溶液的制備方法，制成陰性樣品對照溶液。

3 方法學驗證與結(jié)果

3.1 線性關(guān)系的考察

精密稱取?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧對照品適量加無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液制成每1ml含52.2μg的溶液，分別精密吸取2、6、10、14、18μl測定，以對照品量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，結(jié)果?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧在0.1044～0.9396μg范圍呈良好的線性關(guān)系，計算回歸方程見表1。

表1 標準曲線數(shù)據(jù)

3.2 儀器精密度試驗

取同一供試品溶液，按擬定的色譜條件進樣，連續(xù)測定6次。結(jié)果色譜峰面積RSD值為0.21%，表明所用儀器精密度良好。

3.3 重復(fù)性試驗

取同一供試品6份，按所擬定方法獨立測定6次，結(jié)果?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧的平均含量為0.04%， RSD值為1.02%。

3.4 溶液的穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別在0，3，6，9，18小時，照上述方法測定，按峰面積計算RSD值為1.6%。

3.5 準確度試驗

取已知含量的供試品（含量為 0.17mg/片）6份，精密稱定，分別精密加入對照品溶液（0.0352mg/ml）10ml，按擬定方法測定，計算回收率，測得?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧的平均回收率為96.29%， RSD=0.5% ，結(jié)果表明本法回收率較好，準確度較高。見表2。

表2 回收率測定結(jié)果（n=6）

4 小 結(jié)

4.1 柱的選擇及柱效的考察

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）為流動相；檢測波長為276nm ；柱溫：室溫。分別采用迪馬C18（4.6×250mm，5μm）；大連依利特C18（4.6×250mm，5μm）；大連日普利 C18（4.6×250mm，5μm）的柱測定，結(jié)果迪馬柱理論板數(shù)16642；依利特柱理論板數(shù)16925；大連日普利柱理論板數(shù)17263。

根據(jù)上述三種柱的檢測結(jié)果，同時參照《中國藥典》2015年版一部紫草項下含量測定方法，確定本品理論板數(shù)按?，?′-二甲基丙烯酰阿卡寧峰計算應(yīng)不低于6000。

4.2 供試品制備方法的考察

流動相的選擇：參照《中國藥典》2015年版一部[1]紫草項下含量測定方法，對甲酸的濃度稍作調(diào)整，采用乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）為流動相，結(jié)果分離效果較好，保留時間適度，因此，確定其為本法的流動相

4.3 供試品制備方法的考察

4.3.1 提取溶劑的考察：

取本品20片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取1g ，共取3份，置具塞錐形瓶中，分別加入乙醇，石油醚（60～90℃），無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液各30ml，超聲處理30分鐘，放冷，濾過，分別用乙醇，石油醚（60～90℃），無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗滌殘渣與濾紙，合并濾液，低溫蒸干，殘渣分別用乙醇，石油醚（60～90℃），無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，分別轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，分別加乙醇，石油醚（60～90℃），無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。 按擬定方法測定，結(jié)果以乙醇，石油醚（60～90℃）提取含量為0.137mg/片、0.141 mg/片、無水乙醇－三氯甲烷（3：2）提取含量為0.168 mg/片，故選擇無水乙醇－三氯甲烷（3：2）為本實驗提取溶劑。溶劑色譜無干擾。

4.3.2 提取時間的考察：

取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，精密稱取1g ，共取3份，置具塞錐形瓶中，加入無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液30ml，分別超聲處理15分鐘，30分鐘，60分鐘，放冷，濾過，分別用無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗滌殘渣與濾紙，合并濾液，低溫蒸干，殘渣分別用無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，分別轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，分別加無水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。 依正文方法測定，結(jié)果超聲處理15分鐘比30分鐘，60分鐘低，超聲處理30分鐘、60分鐘結(jié)果相近，故選擇超聲處理30分鐘為本實驗提取時間。