基于網(wǎng)絡藥理學的黑地黃丸治療腎性貧血機制探究

張益慶

（浙江省嘉興市南湖區(qū)余新中心醫(yī)院藥劑科 嘉興314009）

腎性貧血（RA）是由于各種因素造成腎臟促紅細胞生成素（EPO）產(chǎn)生不足或尿毒癥毒素積累干擾紅細胞生成和代謝導致的貧血，是慢性腎衰竭患者常見的并發(fā)癥之一。 目前西醫(yī)治療RA 主要是應用促紅細胞生成素及鐵劑，但因成本較高，給患者帶來巨大的經(jīng)濟壓力，臨床應用受限。 黑地黃丸主要出自《素問病機氣宜保命集》，該集或為張元素所創(chuàng)，黑地黃丸主要由熟地、蒼術、干姜、大棗四味藥組成[1]?！侗Ｃ费缘溃骸爸侮柺㈥幪摚⒛I不足……面多青黃，而無常色，此藥益腎養(yǎng)血。 ”已有研究表明，黑地黃丸可以有效治療慢性腎衰竭所致RA，可提高RA患者的血紅蛋白濃度、紅細胞計數(shù)，對腎功能有一定保護作用[2]，然而目前對黑地黃丸治療RA 的機制研究相對較少。 網(wǎng)絡藥理學是在網(wǎng)絡生物和多向藥理學的基礎上，針對中藥多成分、多靶點、多途徑等特點，提出研究中藥復方或單味藥臨床作用機制的新方法、新策略，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法探究黑地黃丸治療慢腎衰導致的RA 的作用機制。 現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 黑地黃丸藥物成分收集與篩選 基于藥代動力學參數(shù)：吸收、分布、代謝、排泄（ADME），分別以“熟地”“蒼術”“干姜”“大棗”為關鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 按口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 條件篩選中藥成分。

1.2 黑地黃丸有效成分靶點預測 從TCMSP 中查詢黑地黃丸有效成分對應的靶標蛋白， 并導入Unitprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.Unitprot.org/）查詢靶標蛋白的基因名稱，同時進行基因標準化處理。

1.3 RA （Renal anemia） 疾病的靶點 預 測 在OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/） 以關鍵詞“Renal Anemia”進行檢索，對RA 相關的靶點基因進行收集， 并導入Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行基因名標準化處理后歸納整理。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡圖（PPI）的構建與分析 先將黑地黃丸有效成分作用靶點進行去重， 再與RA 疾病靶點組建“成分-疾病”靶點數(shù)據(jù)庫，取兩者交集，組成“成分-疾病”映射文件，即尋找成分與疾病共有的靶點。 運用交集出的共有靶點與化合物成分，通過STRING 數(shù)據(jù)庫建立“黑地黃丸-RA 靶點”的PPI網(wǎng)絡。 運用Cytoscape 軟件對“有效成分-RA”靶點蛋白互作網(wǎng)絡進行節(jié)點度（dregree=8.4）值篩選，得到“有效成分-RA”靶點核心網(wǎng)絡圖。

1.5 GO 生物功能富集分析 將上述作用靶點輸入到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫，進行生物功能富集分析。 再將作用靶點復制到基因搜索列表，對應基因標示符選擇“OFFCIAL-GENE-SYMBOL”物種及背景設定為人，然后進行分析獲得結果。

1.6 KEGG 代謝通路富集分析 利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對相應靶點進行代謝通路分析。 物種及背景設定為人，選擇KEGG-PATHWAY，并以“P＜0.05”進行篩選，最終得到分析結果。

2 結果

2.1 黑地黃丸的有效成分收集和篩選 通過運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以“熟地”“蒼術”“干姜”“大棗”為關鍵詞進行成分搜索， 共得到黑地黃丸有效成分406個，其中熟地76 個，蒼術49 個，干姜148 個，大棗133 個；基于藥代動力學參數(shù)（ADME），按照口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 條件，進行有效性篩選，同時查閱文獻進行補充，共得到黑地黃丸有效成分45 個，其中熟地2 個，蒼術9 個，干姜5 個，大棗29 個，由結果得知黑地黃丸主要包含甾醇類、生物堿、苷類、萜類和黃酮類等成分具有良好的OB 和DL 值，如豆甾醇、槲皮素、葡萄糖苷-qt、繡線菊堿A 等。 見表1。

表1 黑地黃丸有效成分

2.2 黑地黃丸有效成分靶點的預測及與成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建 運用TCMSP 網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫， 將黑地黃丸45 個有效成分在數(shù)據(jù)庫內進行檢索，獲取有效成分的對應靶點，共725 個。 并將靶點導入Unitprot數(shù)據(jù)庫（http://www.Unitprot.org/）進行基因名標準化處理，再通過Cytoscape3.7.2 軟件構建“黑地黃丸-有效成分-靶點”網(wǎng)絡圖，該圖由183 個節(jié)點組成，紅色“V”代表中藥名，綠色圓形代表黑地黃丸有效成分，粉紅色正方形代表有效成分所對應的靶點，節(jié)點與節(jié)點之間的邊表示藥物成分與成分靶點之間的相互作用關系，平均自由度8.4，最大自由度104，最小自由度1。 見圖1。

圖1 黑地黃丸有效成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 疾病靶點信息的收集 在OMIM、PharmGkb、GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“Renal Anemia”“RA”為關鍵詞進行數(shù)據(jù)搜索整理， 其中GeneCards 數(shù)據(jù)庫以“Relevance score＞30”進行篩選，共尋找到靶點基因400 個，其中OMIM（200 個）、PharmGkb（13 個）、GeneCards（187 個）；將以上數(shù)據(jù)庫合并整理后并導入Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行基因標準化處理， 再以Uniprot ID 為標準，用EXCEL 表格的“刪除重復值”功能，對數(shù)據(jù)進行去重，最終篩選得到疾病靶點315個；并運用Cytoscape3.7.2 軟件構建“疾病-靶點”網(wǎng)絡圖。 見圖2。

圖2 RA-疾病-靶點網(wǎng)絡圖

2.4 靶點相互作用網(wǎng)絡構建與分析 利用EXCEL表格篩選功能， 將315 個RA 疾病靶點和725 個藥物有效成分靶點進行合并，取兩者交集，得到藥物成分和疾病的共有靶點17 個，見表2。將這17 個靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫建立“黑地黃丸-RA 靶點”的PPI 蛋白互作網(wǎng)絡，見圖3，共得到17 個節(jié)點，69 條邊，平均節(jié)點度為8.12；將該結果以STV 格式導出，再通過Cytoscape3.7.2 軟件對該網(wǎng)絡進行拓撲分析，以“＞平均Degree 值8.11”為篩選標準，得到12個核心節(jié)點，它們分別是：白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、表皮生長因子受體（EGFR）、干擾素γ（IFNG）、前表皮生長因子（EGF）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白介素-2（IL-2）、凝血酶原（F2）、 糖皮質激素受體（NR3C1）、 一氧化氮合酶（NOS3），具體見圖4。說明該12 個靶點在整個網(wǎng)絡中占據(jù)重要地位， 提示這些靶點可能是黑地黃丸發(fā)揮治療作用的關鍵所在。

表2 藥物-疾病共有靶點

圖3 PPI 蛋白互作圖

圖4 核心靶點網(wǎng)絡圖

2.5 GO生物功能富集分析 運用DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫對17 個潛在作用靶點進行生物功能富集分析，確定了129 個GO 條目。 其中生物學過程（BP）條目最多，有107 個：主要涉及RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、細胞增殖的正調控、基因表達的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控等107 個生物過程；分子功能（MF）相關條目有14 個：主要涉及蛋白質結合、生長因子活性、細胞因子活性、酶結合等分子功能；細胞組成（CC）相關條目有8 個，主要涉及細胞外空間、細胞外區(qū)域、細胞質、質膜等；以靶點富集數(shù)目多少為原則，篩選出前20 條GO 生物功能富集結果。結果提示：黑地黃丸治療RA 可能與蛋白質結合、細胞外空間、細胞質、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等生物功能有關。 見表3。

表3 前20 條GO 生物功能分析

2.6 KEGG 代謝通路富集分析 運用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對17 個潛在作用靶點進行代謝通路富集分析，共獲得39 條通路。以P＜0.05 為條件篩選，按富集基因數(shù)降序原則排序， 得到前20 條KEGG 代謝通路， 其中富集靶點數(shù)目前三位的通路主要包括：HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）。 以上數(shù)據(jù)顯示，黑地黃丸的有效成分可能通過作用于這些代謝通路發(fā)揮其治療RA 的潛在作用。 見表4。

表4 前20 條KEGG 代謝通路富集分析

3 討論

RA 在中醫(yī)學中并無具體病名， 但近代中醫(yī)醫(yī)家學者將其歸屬于“腎勞、虛勞、血枯”等范疇。 病因多為先天不足、后天失養(yǎng)、外感邪氣、內傷勞倦、情志久病、房勞傷腎等有關。 腎病后期五臟俱虛，濁邪壅滯脾胃，使脾胃受納水谷精微失調，氣血化生無源，故氣血虧虛；精可化血，血可養(yǎng)精，腎病日久，腎精虧虛，則血源不足，使貧血加重；故脾腎虧虛為該病的基本病機。

黑地黃丸在治療慢性腎臟病及其并發(fā)癥、 改善腎功能方面具有良好效果。 中藥具有多成分、 多靶點、多途徑的特點，本研究運用網(wǎng)絡藥力學方法探討黑地黃丸治療RA 的物質基礎和分子作用機制。 研究結果顯示， 黑地黃丸與RA 共有17 個公共靶點，經(jīng)過PPI 網(wǎng)絡分析和拓撲分析后共得到12 個核心靶點 ：IL-6、TNF、VEGFA、EGFR、IFNG、EGF、HMOX1、TP53、IL-2、F2、NR3C1、NOS3，提示該藥治療RA 具有多組分、 多靶點的特點。 現(xiàn)代醫(yī)學認為RA 多屬慢性病貧血（ACD），可能與鐵吸收異常、巨噬細胞釋放鐵障礙、EPO 表達異常等有關。 有研究顯示IL-6 通過炎性機制反應，可引起鐵代謝紊亂導致貧血，從而參與造血調控[3]；TNF-琢是造血負調控因子，影響鐵代謝，可以抑制紅系造血功能[4]；林雪峰等[5]分析發(fā)現(xiàn)免疫及炎癥反應所介導的TNF-琢和IL-6 可能通過影響鐵代謝和EPO 生成抑制、EPO 的反應鈍化等途徑參與ACD 的發(fā)生發(fā)展；王歡等[6]研究發(fā)現(xiàn)貧血情況下VEGFA 生成增多， 會促進組織血管生成，從而代償性增加氧氣利用率；HMOX1 可分解血紅素產(chǎn)生鐵，是鐵在體內重復利用的重要來源，在鐵代謝中發(fā)揮關鍵作用；因此可以推測其調節(jié)障礙會導致鐵的缺乏，從而引起貧血；EGF 可能與骨髓血管生成和造血有關[7]；眾多研究發(fā)現(xiàn)細胞毒性T淋巴細胞可分泌造血負調控因子IFN-γ，具有較強的造血抑制活性[8]；NOS 作為合成一氧化氮（NO）的關鍵酶，也是造血負調控因子，INF-γ 還能強烈誘導一氧化氮合酶表達，通過促進NO 合成、釋放來抑制造血功能；還有研究發(fā)現(xiàn)貧血與免疫機制密切相關[9]，IL-2 不僅可反映T 細胞的功能，并且IL-2 異常與再生障礙性貧血（AA）的造血抑制有關。 由KEGG 代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)靶點蛋白富集在HIF-1 信號通路上數(shù)目最多， 預測黑地黃丸治療RA 可能主要通過該通路發(fā)揮作用；HIF-1（低氧誘導因子）通過模擬機體缺氧，刺激機體產(chǎn)生內源性EPO，可提高紅細胞對鐵的利用性， 從而實現(xiàn)治療RA 的目的[10]；PI3K-Akt 信號通路參與調節(jié)造血干細胞的生長、增殖和存活等重要生物過程，過度激活該信號通路會造成造血干細胞的耗竭[11]；癌癥與炎性反應密切相關， 富集在癌癥通路上的EGFR，IL-6，VEGFA，TP53，EGF 等可能通過炎癥反應、細胞增殖與分化、氧化應激等生物過程參與對RA 的治療； 于生友等[12]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路在腎小球足細胞凋亡中發(fā)揮保護腎小球足細胞作用； 推測黑地黃丸可以通過利用以上多種通路的調控保護腎功能， 改善尿毒癥誘導的紅細胞生成抑制、鐵利用障礙[13]等。

綜上所述，黑地黃丸治療RA 具有多靶點、多通路、多成分特點，同一靶點可通過多個信號通路和生物過程發(fā)揮作用，其機制較為復雜。本研究明確了黑地黃丸治療RA 的物質成分基礎及潛在作用靶點，并通過富集分析闡釋了黑地黃丸作用的信號通路和分子機制， 為RA 的臨床治療和實驗研究提供了新方法、新思路。