Cx43縫隙連接蛋白羧基末端磷酸化修飾對其功能的調(diào)控及其在腦缺血中的研究進展

左夏林 唐艷艷 李孔平 彭林輝 徐恩

廣州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣州 510260）

連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成的細胞間縫隙連接（gap junction，GJ），通過相鄰細胞之間的物質(zhì)、能量交換及電、化學(xué)信號耦合，可以創(chuàng)建獨特的細胞信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，形成縫隙連接細胞間通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）。GJIC在神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長、分化以及遷移等生理、病理過程中具有重要作用［1］。在人類連接蛋白家族的21個成員中，連接蛋白43（connexin 43，Cx43）是機體內(nèi)分布最為廣泛，研究最為成熟的連接蛋白家族成員。Cx43合成于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體，并在高爾基體內(nèi)寡聚化，形成由6個連接蛋白組成的半通道，然后轉(zhuǎn)運至細胞膜聚集形成GJ。Cx43的磷酸化修飾主要發(fā)生在細胞質(zhì)的羧基末端（carboxyl terminal，CT），它通過調(diào)節(jié)Cx43的折疊、運輸、積聚、對接和降解，進而直接或間接影響GJJC［2-4］。本文主要對Cx43的CT磷酸化修飾調(diào)控Cx43蛋白功能及其對GJIC的影響以及Cx43在腦缺血中的作用進行綜述。

1 Cx43的結(jié)構(gòu)特點及生理功能

Cx43由382個氨基酸組成，含有四個α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域。Cx43從N端至C端出入細胞膜共四次，形成兩個細胞外環(huán)（extracellular loops，EL1、EL2），一個胞質(zhì)環(huán)（cytoplasmic loop，CL），以及朝向細胞質(zhì)的 N-末端（amine terminal，NT）和 C-末端［5］。Cx43處于動態(tài)變化過程，半衰期大約1.5～5.0 h，它首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體上合成，然后被運輸?shù)礁郀柣鶑?fù)合體，最后在細胞膜上聚集形成Cx43半通道。兩個Cx43半通道在細胞膜相互錨定后對接在一起，形成一個直徑約1.5～2.0 nm的親水性通道，即GJ。Cx43形成的GJ通道允許分子直徑＜1.5 nm和分子量＜1.2 kDa的小分子物質(zhì)通過，如無機離子（Na+、K+、H+等）、代謝物、第二信使（如Ca2+、cAMP、cGMP、IP3）、micro RNA和其他信號分子［6-7］。多個GJ聚集在一起，形成斑片狀，GJ斑的數(shù)目決定了細胞間通訊功能的差異。相鄰細胞間通過GJ所介導(dǎo)的GJIC進行著信號傳遞、物質(zhì)及能量交換，對細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、新陳代謝、增殖和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用［8-9］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中，各種類型神經(jīng)細胞之間存在著不同類型的GJ，使得神經(jīng)細胞間形成高度互連的網(wǎng)絡(luò)。星形膠質(zhì)細胞的GJ允許離子和代謝物快速在細胞之間交換，對K+和谷氨酸的緩沖，Ca2+波傳播和突觸可塑性至關(guān)重要［10-11］。未配對形成GJ的Cx43連接蛋白可以作為半通道，負責(zé)向細胞外環(huán)境釋放包括ATP、谷氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和D-絲氨酸等膠質(zhì)遞質(zhì)［12］，從而對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞之間的營養(yǎng)物質(zhì)代謝和電信號傳導(dǎo)起重要作用。

2 Cx43羧基末端磷酸化修飾在其縫隙連接中的作用

作為相對保守的基因和蛋白質(zhì)家族，Cx43之間的區(qū)別主要在于胞質(zhì)CT的長度和序列。Cx43 CT是Cx43序列上長約150個氨基酸，占整個Cx43蛋白的39%。Cx43 CT富含脯氨酸和絲氨酸的成分，使得CT成為蛋白質(zhì)相互作用和蛋白激酶的潛在靶標，對于調(diào)控GJIC的功能至關(guān)重要［13］。Cx43蛋白的CT肽鏈包含了復(fù)雜的磷酸化位點，是Cx43磷酸化的主要區(qū)域。在穩(wěn)態(tài)細胞的生命周期中，Cx43 CT的磷酸化狀態(tài)除了快速調(diào)節(jié)通道的開放/閉合狀態(tài)，還可通過影響Cx43的合成、轉(zhuǎn)運、聚集/解聚和降解等不同環(huán)節(jié)［14-20］，改變活化通道數(shù)量，最終實現(xiàn)對縫隙連接功能的調(diào)控。例如，在體外培養(yǎng)的HeLa細胞中，轉(zhuǎn)染了Cx43 CT突變體后，與正常Cx43 CT相比，Cx43轉(zhuǎn)運到細胞膜形成GJ的效率明顯下降［21］。PKA通過與Ezrin蛋白形成復(fù)合物，靶向調(diào)控Cx43 CT的Ser369和Ser373位點，刺激cAMP生成進而增強細胞間的GJIC［22］。SLAVI等［23］將出生后7～12 d的小鼠放置于75%氧氣中5 d誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變，缺氧后雖未觀察到視網(wǎng)膜處Cx43半通道的開放，卻發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞之間的GJ偶聯(lián)增加。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是酪蛋白激酶1δ（casein kinase 1delta，CK1δ）使 Cx43 Ser325/328/330位點磷酸化，加速Cx43半通道裝配成GJ斑，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞之間的GJ偶聯(lián)增加。

Cx43 CT的磷酸化修飾除了使GJIC增強，也可抑制GJIC。有研究表明，病毒癌基因編碼的蛋白酪氨酸激酶v-Src使Cx43 CT中Tyr247和Tyr265位點的磷酸化，從而抑制GJIC［11］。一方面原癌基因編碼的c-Src蛋白通過激活G蛋白偶聯(lián)受體來破壞細胞間的GJIC［24］，另一方面通過c-Src SH2結(jié)構(gòu)域與Cx43 Tyr265相互結(jié)合并使Cx43磷酸化后，抑制Cx43和緊密連接蛋白1之間的內(nèi)源性相互作用，從而抑制GJIC［25］。細胞生長因子誘導(dǎo)的GJIC抑制過程同樣也受到Cx43 CT磷酸化修飾的影響。例如表皮生長因子通過MAPK介導(dǎo)的Cx43 Ser255，Ser279 和 Ser282 處磷酸化而快速抑制 GJIC［26］；血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的GJIC抑制涉及MAPK和PKC信號通路的激活［27］。

3 Cx43及其縫隙連接通道在腦缺血中的作用

3.1 Cx43在腦缺血中的變化 Cx43是腦組織中含量最豐富的縫隙連接蛋白之一，是星形膠質(zhì)細胞通過形成縫隙連接和半通道發(fā)揮各種生理功能所必需的，在腦缺血發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的關(guān)注［28］。在光化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)缺血模型中，缺血后1 d，梗死周圍感覺皮質(zhì)Cx43 mRNA水平減少；而缺血后3～7 d，Cx43 mRNA水平逐漸升高。免疫組化顯示缺血后1～14 d，Cx43免疫活降低；缺血后30～120 d，Cx43免疫活性恢復(fù)至缺血對側(cè)部位水平［29］。LI等［30］發(fā)現(xiàn)在大鼠全腦缺血10 min再灌注4～48 h后，海馬CA1 Cx43蛋白水平降低。然而，目前的研究數(shù)據(jù)表明，缺血后腦內(nèi)Cx43的變化不盡相同。在小鼠大腦中動脈永久性閉塞后2 h和3 h，皮質(zhì)核心缺血區(qū)Cx43蛋白表達顯著增加；然而，在6 h后Cx43水平顯著降低，這種減少可能是由于缺血區(qū)域的細胞死亡伴隨Cx43的降解［31］。在低氧/腦缺血損傷新生鼠中，缺血腦組織Cx43在低氧/腦缺血損傷后4 h升高，在低氧/腦缺血損傷后7 d進一步升高，總Cx43水平幾乎升高18倍，表明Cx43在腦缺血損傷病理生理過程的早期（24 h內(nèi)）和晚期（24 h至數(shù)周）都發(fā)揮作用［32］。Cx43在缺血性卒中后的變化，可能與缺血的時間、缺血的部位以及組織損傷的程度有關(guān)。此外，很多研究只是觀察總的Cx43水平，并未觀察Cx43的磷酸化水平變化。

3.2 Cx43及其縫隙連接在腦缺血中的作用 Cx43在腦缺血中的作用仍存在爭議。在特異性敲除星形膠質(zhì)細胞Cx43的小鼠中發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，Cx43（+/-）小鼠大腦中動脈遠端閉塞后4 d缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞凋亡加劇，小鼠腦梗死體積增大［31］。筆者認為Cx43（+/-）小鼠大腦中，缺乏Cx43的星形膠質(zhì)細胞可能無法通過縫隙連接從缺血核心病變中清除細胞毒性物質(zhì)和凋亡起始因子，從而導(dǎo)致Cx43（+/-）小鼠表現(xiàn)出嚴重的腦卒中病變，這表明星形膠質(zhì)細胞之間的GJIC在缺血損傷的病理過程中發(fā)揮著重要作用［33］。Cx43除了形成細胞間縫隙連接外，未形成縫隙的連接蛋白還可能形成半通道，運輸釋放ATP、谷氨酸和谷胱甘肽等物質(zhì)到周圍環(huán)境。LIN等［34］發(fā)現(xiàn)在小鼠的大腦中動脈閉塞模型中，低氧預(yù)處理具有神經(jīng)保護作用，敲除Cx43的小鼠模型則對低氧預(yù)處理不敏感。結(jié)果顯示低氧預(yù)處理減少了Cx43的降解，導(dǎo)致質(zhì)膜Cx43半通道的數(shù)量顯著增加，ATP通過半通道外流導(dǎo)致其分解代謝產(chǎn)物腺苷的積累，從而達到神經(jīng)保護作用。有研究顯示Cx43的神經(jīng)保護作用主要受它的CT區(qū)域調(diào)節(jié)，Cx43 CT的磷酸化位點在縫隙連接組裝和活性中起重要作用。在截斷Cx43 CT258位殘基的突變小鼠中，截斷CT段這個區(qū)域可以去除CK1、PKA、PKC和多數(shù)MAPK磷酸化的位點；同時與Src、PDZ zona occludens 1結(jié)合的區(qū)域也被去除［35］。研究結(jié)果顯示，與野生型小鼠大腦中動脈閉塞模型相比，Cx43 CT區(qū)域突變導(dǎo)致小鼠大腦中動脈閉塞模型梗死體積更大，皮層梗死半暗帶區(qū)域星形膠質(zhì)細胞增生減少，小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加。同時，與野生型小鼠相比，Cx43 CT區(qū)域突變導(dǎo)致小鼠皮層Cx43蛋白表達降低；此外，Cx43 CT區(qū)域突變形成縫隙連接通道減少，半通道活性降低［35］。

然而，也有學(xué)者認為Cx43半通道是“病態(tài)孔”，在細胞應(yīng)激異常時開放［36-38］；當致病因子在應(yīng)激細胞中積累時，可通過縫隙連接實現(xiàn)從細胞到細胞的擴散，影響疾病病理改變，促進損傷的擴散。有研究證明刺激誘導(dǎo)Cx43半通道開放后，可導(dǎo)致神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放［28］。在大腦缺血條件下，受損神經(jīng)元釋放出大量的ATP，在缺血性半暗帶區(qū)，從缺血核心區(qū)域星形膠質(zhì)細胞Cx43半通道釋放的ATP將誘導(dǎo)神經(jīng)元的進一步損傷［39］。FRANTSEVA等［40］在體外缺血模型中研究發(fā)現(xiàn)將海馬切片浸入缺氧-低糖的培養(yǎng)基中48 h后，用反義寡核苷酸抑制Cx43的表達可顯著減少缺氧-低糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡。XIE等［41］在大鼠MCAO模型證實腦缺血后3 d和7 d海馬Cx43表達明顯上調(diào)，通過下調(diào)Cx43可顯著增加海馬錐體神經(jīng)元的存活率并改善行為學(xué)評分，減輕梗死同側(cè)海馬的萎縮。LI等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，在低氧/腦缺血損傷新生鼠中，缺血腦組織Cx43蛋白水平增加；抑制Cx43縫隙連接可以顯著縮小梗死體積，減輕缺血皮層和紋狀體膠質(zhì)細胞的激活，恢復(fù)其缺血后的神經(jīng)功能。在小鼠大腦中動脈閉塞模型中，阻斷Cx43半通道可以縮小小鼠皮層梗死體積；同時，敲除MAPK激酶位點的Cx43S255/262/279/282A（MK4）也可以導(dǎo)致皮層缺血區(qū)域星形膠質(zhì)細胞Cx43半通道活性降低，縮小小鼠皮層梗死體積［42］。因此，細胞縫隙連接允許細胞毒性物質(zhì)通過，也將所需的物質(zhì)傳遞到需要的區(qū)域，同時也緩沖興奮性氨基酸和離子的細胞毒性水平。這兩種理論可能都是正確的，而決定縫隙連接是保護性還是破壞性作用的關(guān)鍵因素可能取決于腦缺血部位正常細胞與損傷細胞的比例。

4 調(diào)控Cx43在腦缺血防治中的可能策略

越來越多的研究提示，Cx43在腦缺血損傷中發(fā)揮著重要的作用。由于干預(yù)Cx43的表達及其形成的縫隙連接可能影響腦缺血的預(yù)后，Cx43被認為是治療腦缺血的潛在干預(yù)靶點。例如，甘珀酸是一種非特異性的Cx43半通道阻滯劑。已有研究表明，在氧糖剝奪/復(fù)氧的細胞損傷模型中，星形膠質(zhì)細胞半通道活性升高，廣泛釋放谷氨酸，從而增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細胞死亡。而甘珀酸的加入，可以阻斷谷氨酸的釋放、增加興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體1的水平和下調(diào)谷氨酰胺的表達［43］。此外，甘珀酸可以抑制Cx43半通道開放和ATP的釋放，并將激活的小膠質(zhì)細胞的表型從M1轉(zhuǎn)換為M2，從而在缺血性卒中后提供有效的神經(jīng)保護［44］。

Cx43模擬肽是以GJ的胞外環(huán)或胞內(nèi)環(huán)為靶點的一段堿基序列，包括Gap19、Gap26、Gap27等，可以作為Cx43半通道阻滯劑。Gap26、Gap27對應(yīng)于Cx43的胞外環(huán)中的一段序列，可抑制Cx43縫隙連接通道的形成。新生大鼠腦缺氧/缺血損傷后8小時至7 d，缺血部位Cx43的表達持續(xù)增加。在模型制備前1 h腹腔注射Cx43模擬肽Gap26（10，25，50 μg/kg）或Gap27（25 μg/kg）可顯著縮小腦梗死體積。缺血后24 h腹腔注射Gap26（25 μg/kg），改善了新生大鼠運動協(xié)調(diào)和促進空間記憶能力的功能［32］。Gap19對應(yīng)于Cx43的胞內(nèi)環(huán)中的一段序列，可能干擾Cx43的C-末端尾部和CL的相互作用。有研究表明，Gap19可以縮小小鼠大腦中動脈栓塞模型的腦梗死體積，防止神經(jīng)功能缺損的惡化，減輕白質(zhì)損傷。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)Gap19的神經(jīng)保護作用明顯強于Gap26，可能與Gap26和Gap27不僅抑制Cx43半通道，也抑制Cx43縫隙連接通道有關(guān)［45-46］。

為了使模擬肽能夠通過血腦屏障進入大腦發(fā)揮作用，有研究人員對Cx43模擬肽進行了修飾。例如，在小鼠腹腔注射Gap19-TAT-生物素（7.5 μmol/kg）10 min后，在血管周圍基底層檢測到Gap19-TAT-生物素；80 min后，Gap19-TAT-生物素存在于GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞中，并與Cx43共定位。在大腦中動脈永久閉塞后2 h，腹腔注射0.75 μmol/kg或7.5 μmol/kg Gap19-TAT分別顯著縮小大腦梗死體積［42］。

5 結(jié)語與展望

縫隙連接蛋白的功能異常與多種疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，已是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點［1，47-49］?？p隙連接蛋白家族成員各自有獨有的特征，主要歸因于它們CT的差異。Cx43 CT是所有連接蛋白中研究最廣泛的一個結(jié)構(gòu)域，Cx43 CT結(jié)構(gòu)域的研究對于深入探索其它20種人類細胞縫隙連接蛋白CT的功能，將提供更多的線索和借鑒。Cx43 CT的磷酸化影響了Cx43的轉(zhuǎn)運、GJ的組裝和降解、GJ通道的門控，可作為細胞間縫隙連接開放或關(guān)閉的標志，在腦缺血的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。雖然Cx43及Cx43 CT的磷酸化在腦缺血中的具體作用機制還有待明確，但是Cx43作為細胞間最重要的通訊方式之一，當其表達變化出現(xiàn)異常時，勢必會影響神經(jīng)細胞應(yīng)對環(huán)境的刺激或改變。因此，進一步了解Cx43半通道及其所形成縫隙連接通道，將有助于探討Cx43連接蛋白家族在疾病中的作用機理，為腦缺血及相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供方向和治療策略。