柴胡加龍骨牡蠣湯對帕金森抑郁患者血清代謝組學的影響

秦劭晨，王愛梅，李若瑜，夏 天，周 珊

(1山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院·山西 太原 030024；2廣州中醫(yī)藥大學·廣東 廣州 510006)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見于中老年人的神經退行性疾病，其臨床主要癥狀是震顫、肌肉僵直等運動障礙[1]，而PD的非運動癥狀最常見的是抑郁，研究顯示其患病率為50%左右，抑郁癥狀會降低生活質量，從而降低依從性，加重PD的病程[2]。PD抑郁屬于中醫(yī)學中“郁證”范疇[3]，柴胡加龍骨牡蠣湯是臨床治療諸多精神類疾病的良方之一[4]，本文通過使用1H-NMR技術分析PD抑郁患者服用柴胡加龍骨牡蠣湯后的生物標志物變化，為柴胡加龍骨牡蠣湯治療該病提供實驗室依據。

1 臨床資料

觀察病例為2017年9月—2018年11月就診于山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病科門診及住院部診斷為帕金森病伴抑郁的患者。收集患者30例，采用隨機雙盲法分為帕金森抑郁患者服用藥物前組(P0組)，單純服用多巴絲肼片組(P1組)，在多巴絲肼片基礎上加上柴胡加龍骨牡蠣湯組(P2組)，每組10 例。另外選擇10例體檢確定其身體健康的志愿者(正常對照組，C0組)，收集各組患者的血樣，按常規(guī)制備血清在-80 ℃冰箱中凍存待測。柴胡加龍骨牡蠣湯的制備、病例納入標準和排除標準均按前期報道進行[5]。

2 方法

2.1 治療方法 多巴絲肼片組(P1組)口服多巴絲肼片(上海羅氏制藥有限公司生產，國藥準字H10930198)250～750 mg/d,分1～3次口服，共12 周。柴胡加龍骨牡蠣湯組(P2組)在多巴絲肼片基礎上加上柴胡加龍骨牡蠣湯(組成藥味是柴胡20 g，龍骨、黃芩、生姜、鉛丹、人參、桂枝、茯苓各6 g，半夏4 g，大黃10 g，牡蠣6 g，大棗6顆；中藥顆粒劑為江陰天江藥業(yè)有限公司提供)，開水400 mL沖服，早晚空腹溫服，每日1 劑，服用12周。

2.2 樣品采集及處理方法 入組前和末次用藥2 h后采集各組患者的血樣，按常規(guī)制備血清在-80 ℃冰箱中凍存待測。取解凍后的血清500 μL，加入D2O配制的PBS緩沖液200 μL，充分渦旋均勻后放置于低溫離心機13 000 r/min，4 ℃離心20 min，取其中600 μL澄清上清液，置于標記好的NMR樣品管(內徑5 mm)中進行核磁分析。

2.31H-NMR圖譜制備及處理 在AVANCE III NMR波譜儀(600 MHz)上采集數(shù)據，應用該儀器的1D NOESY脈沖序列，參數(shù)設置為320 ms的自旋弛豫延遲，8 000 Hz的譜寬，64次的掃描次數(shù)，從而得到各組的1H-NMR圖譜。所有圖譜均采用Mest Re Nova核磁圖譜專業(yè)處理軟件，主要采用的是傅立葉轉換并進行相位、基線調整。化學位移校正標準是TSP的化學位移δ3.40，把等寬度的積分數(shù)據歸一化處理后用于多元統(tǒng)計分析。

2.4 ELISA檢測各組血清谷氨酰胺和谷氨酸的含量 將2.2血清解凍后，按試劑盒說明書操作，檢測各組中谷氨酰胺和谷氨酸的含量。谷氨酰胺(貨號：ml064265)、谷氨酸(貨號：ml038308)ELISA試劑盒由上海酶聯(lián)生物技術有限公司提供。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SIMCA-P 13.0軟件分析積分數(shù)據，進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。使用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計處理，數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析。P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組1H-NMR圖譜的比較 根據參考文獻[6]，選擇3個代謝物進行分析比較。帕金森抑郁患者(P0組、P1組、P2組)的谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸含量較空白對照組(C0組)明顯增加(P<0.01)；與P0組比較，給予多巴絲肼片(P1組)或其基礎上加上柴胡加龍骨牡蠣湯(P2組)的谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸含量有所減少(P<0.01)。見表1，表2。

表1 各組患者血清谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸表達強度比較

表2 血清內源性選擇的代謝物歸屬及其化學位移

3.2 選擇差異代謝物依據 見圖1。

如圖1所示，運用SIMCA軟件對空白對照組(C0組)、帕金森抑郁患者(P0組)及其給予不同藥物(P1組和P2組)的患者進行PLS-DA分析，根據核磁數(shù)據進行分析后做出積分圖。再通過OPLS-DA模型得出的S-plot圖，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸差異較為明顯。

圖1 各組PCA積分圖和對應的S-plot圖

3.3 各組患者血清3個差異代謝物相對豐度比較 見圖2。與空白對照組(C0組)比較，帕金森抑郁患者(P0組、P1組、P2組)的谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸相對豐度都顯著增加(P<0.05)，與帕金森抑郁患者(P0組)比較，給予多巴絲肼片(P1組)或加服柴胡加龍骨牡蠣湯(P2組)的谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸相對豐度都顯著減少(P<0.05)。與P1組比較，P2組的谷氨酰胺、谷氨酸、胍基乙酸相對豐度都顯著減少(P<0.05)。

與C0組比較，*P<0.05，**P<0.01；與P0組比較，#P<0.05，##P<0.01；與P1組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01(例數(shù)：10)圖2 各組患者血清3個潛在生物標志物的相對峰面積

3.4 各組患者血清谷氨酰胺和谷氨酸含量的比較 見表3。

表3 各組患者血清谷氨酰胺和谷氨酸含量比較

與空白對照組(C0組)比較，帕金森抑郁患者(P0組、P1組、P2組)的谷氨酰胺和谷氨酸含量都顯著增加(P<0.05)，與P0組比較，給予多巴絲肼片(P1組)或加服柴胡加龍骨牡蠣湯(P2組)的谷氨酰胺和谷氨酸含量都顯著減少(P<0.05)。與P1組比較，P2組的谷氨酰胺和谷氨酸含量都顯著減少(P<0.05)。

4 討論

目前雖然關于帕金森抑郁的發(fā)病機制尚不清楚。中醫(yī)理論認為抑郁的病位主要在腎和肝，肝腎不足會導致氣機失調，有研究報道益腎調肝解郁法針對水寒木郁(腎虛肝郁)型帕金森抑郁患者，通過提高多巴胺等相關神經遞質的含量，減緩抑郁癥狀[7-8]。說明抑制帕金森病主要癥狀發(fā)展對抑郁表現(xiàn)有改善。中醫(yī)理論還有指出治療郁證的病位還有心和脾，宜益氣養(yǎng)心、疏肝理氣才能得到解郁安神的作用[9]。柴胡加龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》，具有疏肝、清熱、安神的功效[10]，符合治療帕金森抑郁的綜合癥狀。柴胡加龍骨牡蠣湯在腦卒中后抑郁[11]、心絞痛抑郁[12]的治療應用報道較多，但應用于帕金森抑郁的報道較少?；A研究報道顯示柴胡加龍骨牡蠣湯能夠縮短抑郁模型小鼠強迫游泳和懸尾不動時間，機制可能是阻斷中樞單胺類遞質的重攝取[13]。本文通過采用血清代謝組學技術觀察其主要差異代謝物來推測其對PD伴抑郁患者的作用機制。

本文通過對NMR圖譜積分分析得出差異較大的是谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸。有報道顯示抑郁患者存在谷氨酸系統(tǒng)異常[14]，主要是在抑郁患者的腦脊液中檢測出谷氨酰胺的異常增高，其主要原因可能是谷氨酰胺循環(huán)的破壞，谷氨酸是神經膠質細胞內合成谷氨酰胺的底物，而谷氨酰胺又能在神經末梢中又轉化為谷氨酸[15]。谷氨酸是具有興奮作用的神經遞質，研究發(fā)現(xiàn)過量的谷氨酸具有引起神經元死亡的神經毒性[16]。胍基乙酸在神經組織能量代謝中具有重要作用，是肌酸的前體物，也是神經調節(jié)重要物質，能夠激活抑制性神經遞質受體，抗氧化以及影響肌肉張力和大腦發(fā)育[17]。本文分析谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸的相對豐度變化中發(fā)現(xiàn)，帕金森抑郁患者的谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸的豐度相對空白對照組上調，給予多巴絲肼片或加服柴胡龍骨牡蠣湯后，該患者的谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸的豐度有所回調。為了定量血清中谷氨酰胺和谷氨酸含量變化，通過試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)含量表達趨勢與相對豐度一致，這說明多巴絲肼片聯(lián)合柴胡龍骨牡蠣湯對帕金森抑郁患者具有明顯的降低谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸含量的作用。提示柴胡龍骨牡蠣湯對帕金森抑郁患者的谷氨酰胺循環(huán)和能量代謝具有一定調節(jié)作用。

綜上所述，柴胡加龍骨牡蠣湯對帕金森抑郁患者血清中谷氨酰胺、谷氨酸和胍基乙酸3個代謝物回調作用明顯，推測柴胡加龍骨牡蠣湯的作用機制是針對氨基酸代謝中谷氨酰胺循環(huán)和能量代謝兩個方面。本實驗結果為進一步研究柴胡加龍骨牡蠣湯的作用靶點提供前期基礎，為柴胡加龍骨牡蠣湯臨床應用提供實驗室依據。