HPLC-CAD法測定硫酸卡那霉素中的硫酸鹽含量

北京市藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室（102206）李珉 侯金鳳 陸巖 車寶泉 王俊秋 李文東

卡那霉素為氨基糖苷類抗生素中具有代表性的藥物之一[1]。目前卡那霉素所有制劑的原料都是以硫酸鹽的形式存在，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)硫酸卡那霉素分子晶體結(jié)構(gòu)中硫酸分子和結(jié)晶水分子個數(shù)的不同，存在多種不同的原料。目前各國藥典中，主要將其區(qū)分為單硫酸卡那霉素單硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·H2SO4)和硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)兩種原料[2]。其中《英國藥典》2017版[3]、《歐洲藥典》9.0版[4]以及《日本藥局方》ⅩⅦ版[5]均收錄了兩種原料，《美國藥典》40版[6]僅收錄了單硫酸卡那霉素，而《中國藥典》2015年版[7]僅收錄了硫酸卡那霉素。雖然各國藥典均收錄了至少一種硫酸卡那霉素原料，但對具體晶體結(jié)構(gòu)卻都沒有說明。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，兩種原料晶體結(jié)構(gòu)具有顯著差異，且硫酸卡那霉素(C18H36N4O11·xH2SO4)可能存在多種不同的晶體結(jié)構(gòu)。因此，檢查硫酸鹽含量對控制分子成鹽度具有重要意義，此外對區(qū)分單硫酸卡那霉素以及硫酸卡那霉素的不同晶型及晶體結(jié)構(gòu)研究具有一定的借鑒意義。

附表1 回收率試驗結(jié)果

附表2 硫酸鹽含量測定結(jié)果

附圖1 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

附圖2 典型的對照品溶液及供試品溶液圖譜

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司），Corona Veo 電噴霧檢測器（CAD）（賽默飛世爾公司），LC-20A高效液相色譜儀（島津公司），2000ES蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）（奧泰公司），X A 2 0 5 電子天平（梅特勒-托利多公司）等。

1.2 對照品 卡那霉素對照品（批號130556-200501，含量6 6.5%）和卡那霉素B 對照品（批號130548-200501）均購自中國食品藥品檢定研究院，硫酸滴定液（批號20161103）由北京市藥品檢驗所配制并標(biāo)定。

1.3 試劑 三氟乙酸、甲醇均為色譜純，購自Merck公司。

1.4 樣品 單硫酸卡那霉素原料，分別來自本溪海大制藥有限公司（企業(yè)A）和古田福興醫(yī)藥有限公司（企業(yè)B）；硫酸卡那霉素原料，來自成都倍特藥業(yè)有限公司（企業(yè)C）。

2 實驗方法及結(jié)果

2.1 HPLC-CAD條件 色譜柱：Waters HSS T3色譜柱（4.6mm×250mm,5μm）；流動相：0.2mol/L三氟乙酸水溶液；流速：0.3mL·min-1；柱溫：30℃；進樣體積：20μL。

噴霧器溫度：3 5 ℃；采樣頻率：1Hz；輸出范圍：100pA；氮氣工作氣壓：58.7psi。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別稱取卡那霉素對照品12.37mg，卡那霉素B對照品8.42mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。精密量取系統(tǒng)適用性試驗溶液20μL注入液相色譜儀，照“2.1”項下條件分析，結(jié)果見附圖1。

硫酸根離子峰與卡那霉素峰分離度達到10.55，卡那霉素峰與卡那霉素B峰分離度達到6.65，硫酸根離子峰理論塔板數(shù)為5432，滿足分析要求。

2.4 檢出限與定量限 量取硫酸滴定液適量，加水溶解并逐級稀釋得系列稀釋溶液，按信噪比為3∶1測定檢測限為0.02μg，按信噪比10∶1測定定量限為0.04μg。

2.6 進樣精密度 精密量取硫酸滴定液0.8ml，置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為硫酸鹽進樣精密度試驗。取“2.4項”下硫酸鹽進樣精密度溶液，重復(fù)進樣6次，以峰面積計算，RSD為0.6%，進樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性 取批號為（20120112-1）樣品，分別精密稱取6份，分別照硫酸鹽測定方法，分別進樣，測定其硫酸鹽含量，結(jié)果的RSD為0.8%。

附圖3 硫酸鹽（SO42-）對照溶液、亞硫酸鹽（SO32-）對照溶液以及硫酸卡那霉素注射液供試品溶液圖譜

2.8 回收率 取批號為20120112-1的樣品約12.5mg，置50mL量瓶中，加入硫酸滴定液0.4mL，重復(fù)配制6份，作為硫酸鹽回收率試驗溶液。計算回收率結(jié)果見附表1，結(jié)果滿足硫酸鹽分析要求。

2.9 硫酸鹽測定 分別取批號為20120112-1、20120203-1、D1405020和D1405022的單硫酸卡那霉素原料樣品以及批號為100701、130701和131001的硫酸卡那霉素原料樣品，按“2.2”項下方法配制供試品溶液及對照品溶液，照“2.1”項下條件分析。典型的對照品溶液及供試品溶液代表圖譜，詳見附圖2。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算硫酸鹽含量，結(jié)果見附表2。

3 討論

由硫酸鹽測定結(jié)果可以看出，單硫酸卡那霉素與硫酸卡那霉素兩種原料所含硫酸鹽含量顯著不同。目前《中國藥典》2015年版中收載了硫酸卡那霉素原料，其硫酸鹽含量的限度為按干燥品計算的23.0%～26.0%，《美國藥典》40版中收載了單硫酸卡那霉素，其硫酸鹽含量的限度為按干燥品計算的15.0%～17.0%。采用建立的HPLCCAD法，兩種原料藥測定結(jié)果分別在15.0%～17.0%和23.0%～26.0%范圍內(nèi)，這也從側(cè)面印證了兩種原料具有不同的分子組成，為兩個不同的藥品品種。

綜上所述，本文建立了用于測定硫酸卡那霉素原料藥中硫酸鹽含量的HPLC-

CAD法，以代替現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的容量滴定法。高效液相色譜法相較容量滴定法具有專屬性強、分離度高的優(yōu)勢。同時，CAD檢測器可以彌補傳統(tǒng)紫外檢測器對硫酸鹽測定不適用的問題。新建的HPLC-CAD法結(jié)合了專屬性強的分離能力以及靈敏度高的檢測能力，可以更有效地進行硫酸鹽測定。此外，新建的HPLC-CAD法還具有用于其他氨基糖苷類抗生素原料藥中硫酸鹽含量測定的潛力。