癌組織lncRNA H19和血清前列腺特異抗原水平與前列腺癌病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

徐 峰，楊 勇，劉忠平

(1.航天中心醫(yī)院泌尿外科，北京 100049；2.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心泌尿外科，北京 100037)

目前，針對前列腺癌(PCa)的術(shù)前診斷和預(yù)后判斷方法均存在著的一定不足[1]，前列腺特異抗原(PSA)等標(biāo)志物雖然敏感度較高，但受到多種混雜因素影響，有研究[2]證實了長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)異常與泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，lncRNA H19已被證實在多種惡性腫瘤病程中具有重要作用，但其能否用于提示PCa病理特征并預(yù)測患者預(yù)后仍存在爭議。本研究針對癌組織lncRNA H19和血清PSA水平與PCa病理特征及預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年3月至2017年3月由航天中心醫(yī)院收治的89例PCa患者作為病例組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016年發(fā)布的《前列腺癌指南》中的PCa診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②患者均為局限PCa，臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期；③預(yù)期壽命≥10年；④具有行根治手術(shù)指證，均擇期開放式恥骨后PCa根治術(shù)和腹腔鏡PCa根治術(shù)。選取同期100例良性前列腺增生(BPH)患者作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會泌尿外科分會于2006年制訂的《良性前列腺增生臨床診治指南》中的BPH診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②具有手術(shù)指證，均為擇期行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)、經(jīng)尿道前列腺切開術(shù)或開放前列腺摘除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心血管疾病、肺功能不良、肝腎功能衰竭、嚴(yán)重出血傾向或凝血功能障礙者；②復(fù)發(fā)性PCa患者；③術(shù)前明確確診腫瘤骨轉(zhuǎn)移者；④合并其它部位惡性腫瘤者；⑤術(shù)前已接受抗腫瘤治療者。所有患者均簽署知情同意書自愿參，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過。

1.2 方法

1.2.1前列腺組織lncRNA H19相對表達(dá)量檢測 取兩組患者術(shù)中切除前列腺病灶組織切片，經(jīng)脫蠟等處理后采用Trizol reagent RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA，采用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測病灶組織中的lnRNA H19相對表達(dá)量，檢測儀器為ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，采用cDNA：PrimerScriptTMRT試劑盒將2 μg RNA提取物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴增，以U6為內(nèi)參，目標(biāo)RNA的PCR擴增引物序列見表1，采用20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃變性5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共反應(yīng)40個循環(huán)，72 ℃ 20 s，78 ℃ 20 s采集熒光，采用熔解曲線及瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果計算循環(huán)閾值(Ct)，采用2-△△Ct法計算目標(biāo)RNA的相對表達(dá)量。

表1 目標(biāo)RNA的PCR擴增引物序列

1.2.2血清PSA水平檢測 于入院次日常規(guī)采集兩組患者的空腹外周靜脈血樣本，采用免疫層析法檢測血清PSA水平進(jìn)行檢測，以≤5.0 ng/ml為血清PSA水平正常生理范圍，將血清PSA水平≥20 ng/ml判定為高血清PSA水平。

1.2.3基線資料及病理特征收集 通過查閱病歷針對兩組患者的年齡、合并基礎(chǔ)疾病及前列腺體積等基線資料進(jìn)行對比，同時對病例組患者的腫瘤直徑、臨床分期、Gleason病理分級評分、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征進(jìn)行統(tǒng)計和調(diào)查。

1.2.4預(yù)后情況調(diào)查 所有患者均于術(shù)后給予最長36個月的隨訪，隨訪方式以電話微信隨訪為主，每周至少隨訪一次，每三個月至少進(jìn)行一次門診隨訪，如患者不能按期接受隨訪，則進(jìn)行登門隨訪，對患者的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)進(jìn)行隨訪，其中，OS的終點事件為患者全因死亡，PFS的終點事件為腫瘤進(jìn)展或復(fù)發(fā)，如患者者生存期長于末次隨訪，其生存數(shù)據(jù)記為刪失數(shù)據(jù)。

1.3 觀察指標(biāo)①觀察患者術(shù)中切除前列腺病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量、入院時血清PSA水平。②病例組患者基線資料及病理特征，術(shù)后患者總生OS和PFS。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 23.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗；偏態(tài)資料比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；OS、PFS的比較采用Kaplan-Meier生存分析法；采用Cox風(fēng)險回歸模型對患者OS和PFS相關(guān)因素進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料、病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平比較兩組基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，病例組病灶組織中l(wèi)ncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組基線資料、病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平比較

2.2 不同病理特征PC患者病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平的比較不同年齡、合并糖尿病情況、前列腺體積、臨床分期、Gleason評分、腫瘤分化程度患者血清PSA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同臨床分期、Gleason評分、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的病灶組織中l(wèi)ncRNA H19相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病理特征PC患者病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平的比較

2.3 病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平與PCa患者預(yù)后的相關(guān)性隨訪期截至2020年3月，本組患者的總體OS和PFS估計值為25.181個月和23.158個月，以患者術(shù)中切除腫瘤病灶lncRNA H19相對表達(dá)量平均值為界值將患者分為高lncRNA H19表達(dá)組(病灶lncRNA H19相對表達(dá)量≥1.45，45例)和低lncRNA H19表達(dá)組(病灶lncRNA H19相對表達(dá)量<1.45，44例)，根據(jù)血清PSA水平將患者分為高血清PSA水平組(48例)和低血清PSA水平組(41例)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，高lncRNA H19表達(dá)組OS和PFS均低于低lncRNA H19表達(dá)組(P<0.05)，而高血清PSA水平組和低血清PSA水平組OS和PFS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖1。Cox風(fēng)險回歸模型分析結(jié)果顯示，前列腺患者術(shù)后OS與病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Gleason評分、分化程度相關(guān)(P<0.05)，術(shù)后PFS與病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、Gleason評分相關(guān)(P<0.05)，其中，較高的病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量是患者不良預(yù)后風(fēng)險的因素。見表5、表6。

表4 不同病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平患者術(shù)后OS和PFS比較

圖1 不同病灶組織lncRNA H19相對表達(dá)量和血清PSA水平患者術(shù)后OS和PFS的Kaplan-Meier生存分析曲線 a：lncRNA H19；b：PSA

表5 前列腺患者術(shù)后OS相關(guān)因素的Cox風(fēng)險回歸模型分析

表6 前列腺患者術(shù)后PFS相關(guān)因素的Cox風(fēng)險回歸模型分析

3 討論

Gleason評分用于輔助預(yù)測術(shù)后局部復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，而有無陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是決定PCa預(yù)后的關(guān)鍵因素[5]。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)病理學(xué)分級及臨床分期對PCa的預(yù)后評價存在一定的局限性，腫瘤相關(guān)基因在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用及其預(yù)后預(yù)測價值越來越受到關(guān)注，lncRNA、微小RNA(miRNA)、環(huán)狀RNA(circRNA)等ncRNA攜帶著腫瘤遺傳信息、能夠?qū)ο掠伟谢蚝湍[瘤微環(huán)境發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，在PCa診療方面得到了廣泛的應(yīng)用，研究[6]已證實了PCa組織中的多種miRNA表達(dá)異常與患者預(yù)后有關(guān)，作為miRNA的上游調(diào)控基因，lncRNA能夠通過發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用參與PCa細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等的調(diào)控，在PCa的診斷、治療及預(yù)后方面應(yīng)用潛力巨大，有望作為用于PCa的早期診斷、靶向治療等方面。lncRNA的異常表達(dá)可作用于表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個基因調(diào)控水平，導(dǎo)致PCa細(xì)胞生物學(xué)行為改變，一些lncRNA被證實與PCa的去勢抵抗性密切相關(guān)，有多種從PCa癌組織、前列腺液、血清、尿液等標(biāo)本中檢出的異常表達(dá)lncRNA可影響腫瘤對于放療和化療的反應(yīng)性，還有一些lncRNA的異常表達(dá)與患者的預(yù)后有關(guān)[7]，這也成為了PCa研究領(lǐng)域的熱點。

通過本研究可見，PCa癌組織中l(wèi)ncRNA H19相對表達(dá)量出現(xiàn)了上調(diào)，且與腫瘤的病理特征和患者的預(yù)后相關(guān)。lncRNA H19是最早發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一，位于人類染色體11p15.5上，可與胰島素樣生長因子2(IGF-2)產(chǎn)生相互作用，是一種表現(xiàn)出父系印記的lncRNA分子。lncRNA H19在多種腫瘤組織中存在表達(dá)異常并與不良預(yù)后具有相關(guān)性，能夠與多種癌基因、抑癌基因、miRNA發(fā)生相互作用，從而調(diào)控腫瘤的生長、增殖、分化凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。lncRNA H19在PCa組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，通過抑制其表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的生長能力、葡萄糖消耗量和乳酸生成量，達(dá)到抑癌作用；lncRNA H19 rs2839698、rs2735971基因單核苷酸多態(tài)性與PCa易感性有關(guān)，攜帶突變等位基因的人群的PCa發(fā)生風(fēng)險較高。然而，腫瘤組織中的lncRNA H19過表達(dá)與PCa預(yù)后的相關(guān)性仍不明確，而本研究結(jié)果支持了癌組織lncRNA H19高表達(dá)與PCa患者不良預(yù)后有關(guān)的結(jié)論，這提示了lncRNA H19也可作為PCa的預(yù)后評價指標(biāo)及治療靶點。事實上，lncRNA H19在促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展中的機制十分復(fù)雜，除了上述提到了與腫瘤細(xì)胞能量代謝的相關(guān)性之外，主要還包括以下幾個方面的機制：①lncRNA H19可對miRNA-675、miRNA-107、miRNA-141等下游靶基因進(jìn)行調(diào)控，從而提升癌細(xì)胞在機體內(nèi)增殖與侵襲能力[8，9]；②高表達(dá)的lncRNA H19可對E-cadherin、Bcl2、CPT1C、Atg7等相關(guān)蛋白信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[10～12]；③腫瘤細(xì)胞以lncRNA H19高表達(dá)外泌體方式通過激活PI3K/AKT/mTOR等信號通路增強了鄰近腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的侵襲和進(jìn)展[13]；④腫瘤組織中l(wèi)ncRNA H19的高表達(dá)能夠降低腫瘤細(xì)胞對紫杉醇、替莫唑胺等化療藥物的敏感性，從而對患者的生存期產(chǎn)生不良影響[14，15]。但上述結(jié)論均源自針對其它種類惡性腫瘤的研究結(jié)果，lncRNA H19高表達(dá)導(dǎo)致PCa不良預(yù)后的確切機制仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究予以證實和討論。

綜上所述，PCa癌組織中存在lncRNA H19相對表達(dá)量上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤的病理特征和患者的預(yù)后具有相關(guān)性，可作為預(yù)測患者預(yù)后的輔助指標(biāo)和潛在治療靶點，患者術(shù)前血清PSA水平雖與病理特征具有相關(guān)性，但其水平受到多種因素影響，與患者的預(yù)后缺乏相關(guān)性。