軟體動物皰疹病毒及其對貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的危害*

白昌明 辛魯生 王崇明

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071)

貝類增養(yǎng)殖是海水養(yǎng)殖業(yè)的重要支柱之一，具有重要的社會、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。近年來，中國海水貝類養(yǎng)殖的年產(chǎn)量呈穩(wěn)步上升趨勢；2018 年，中國海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)1444 萬t，占海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的71.1%(中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。隨著貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)總體規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖病害問題日益嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019 年中國貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)因疫病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)88.7 億元(中國水生動物衛(wèi)生狀況報(bào)告)。受流行性疫病的影響，中國部分地區(qū)、部分種類的貝類養(yǎng)殖規(guī)模大幅萎縮，甚至瀕臨崩潰。如20 世紀(jì)90 年代末，中國北方養(yǎng)殖櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和南方養(yǎng)殖雜色鮑(Haliotis diversicolor supertexta)，分別因感染牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)和鮑皰疹病毒(Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1)暴發(fā)大規(guī)模死亡。受此疫情影響，中國養(yǎng)殖櫛孔扇貝年產(chǎn)量從發(fā)病前(1996 年)的60 多萬t 驟減到1998 年不足20 萬t (Guo et al, 2016)；雜色鮑在全國鮑產(chǎn)量中的占比由發(fā)病前的65%驟降至不足5%(Wu et al, 2016)。與此同時(shí)，OsHV-1 和HaHV-1 病害也在其他國家頻繁發(fā)生，分別引起雙殼貝類和腹足貝類的大規(guī)模死亡，成為近年來威脅全球貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要疫病。本文對OsHV-1 和HaHV-1 2 種皰疹病毒的出現(xiàn)與傳播、病毒特征與變異演化、致病特征與診斷技術(shù)，以及此類病毒病的防控等方面取得的重要研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和回顧，并展望未來軟體動物皰疹病毒研究和病害防控工作的重點(diǎn)。

1 軟體動物皰疹病毒的發(fā)現(xiàn)與傳播

1.1 牡蠣皰疹病毒的發(fā)現(xiàn)及對中國貝類養(yǎng)殖業(yè)的危害

首例貝類感染皰疹病毒的案例發(fā)現(xiàn)于1972 年，宿主是來自美國馬里蘭州的一批實(shí)驗(yàn)用養(yǎng)殖美洲牡蠣(Crassostrea virginica)，這也是皰疹病毒感染無脊椎動物的首例報(bào)道(Farley et al, 1972)。此次感染案例僅限于實(shí)驗(yàn)用貝，未對養(yǎng)殖和野生貝類種群造成影響。Farley 等對引起感染的皰疹樣病毒病原僅進(jìn)行了電鏡觀察，未開展進(jìn)一步研究。皰疹病毒對貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的危害真正引起人們廣泛關(guān)注是1991 年以來，相關(guān)流行病相繼在歐洲、澳洲和南、北美洲多國發(fā)生，引起以長牡蠣(Crassostrea gigas)為代表的多種養(yǎng)殖雙殼貝類大規(guī)模死亡(Hine et al, 1992; Renault et al,2001b; Barbosa-Solomieu et al, 2015)。Davison 等(2005)對感染法國長牡蠣幼蟲的病毒粒子進(jìn)行純化、電鏡觀察、全基因組測序和比對分析，發(fā)現(xiàn)感染長牡蠣等貝類的皰疹病毒為一種新皰疹病毒。2008 年，國際病毒分類委員會(ICTV)將感染雙殼貝類的皰疹病毒正式命名為牡蠣皰疹病毒 1 (Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)。我國首例因皰疹病毒感染引起的貝類致死案例發(fā)生于1997 年，引起我國北方養(yǎng)殖櫛孔扇貝在高溫季節(jié)持續(xù)發(fā)生大規(guī)模死亡。根據(jù)此次疫病流行和致病特點(diǎn)，中國科研人員將其命名為扇貝急性病毒性壞死病(AVND)(宋微波等, 2001)，對應(yīng)的病原稱為扇貝急性病毒性壞死病毒(AVNV) (王崇明等, 2002)。對AVNV 基因組序列測定和分析結(jié)果顯示，AVNV 與OsHV-1 基因組相似度達(dá)97%，為同一種病毒的不同變異株(Ren et al, 2013)。

與歐美等國頻繁發(fā)生OsHV-1 感染引起的長牡蠣死亡不同，中國受OsHV-1 感染影響的貝類種類更加多元化(Bai et al, 2015)，其中，受影響較大的貝類及其首次發(fā)現(xiàn)年份分別為：櫛孔扇貝(1997 年)、長牡蠣(2009 年)、魁蚶(Scapharca broughtonii) (2012 年)和毛蚶(Scapharca subcrenata) (2019 年)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1997 年暴發(fā)的AVND 導(dǎo)致山東省2 萬hm2養(yǎng)殖櫛孔扇貝60%絕產(chǎn)，直接經(jīng)濟(jì)損失約15 億元，1998 年的疫情更加嚴(yán)重(張福綏等, 1999)。中國長牡蠣感染OsHV-1 的案例最早報(bào)道于2009 年，僅造成人工繁育幼蟲的死亡(未發(fā)表數(shù)據(jù))。韓國(2009 年)、日本(2010 年)也相繼報(bào)道了長牡蠣感染OsHV-1 的案例，尚未出現(xiàn)對其國內(nèi)長牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅的大規(guī)模疫情(Hwang et al, 2013; Nagai et al, 2018)。近年來，中國牡蠣人工育苗比例越來越大，2019～2020 年對遼寧和福建等地育苗場開展的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，OsHV-1 感染引起的牡蠣幼蟲死亡事件頻繁發(fā)生，發(fā)病幼蟲樣本病毒載量達(dá)106～107病毒拷貝/ng 總DNA(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

2012～2018 年，中國北方育苗場及出口加工企業(yè)室內(nèi)暫養(yǎng)的魁蚶成貝頻繁發(fā)生大規(guī)模死亡，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和病原鑒定，確定一種OsHV-1 新變異株是引發(fā)魁蚶大規(guī)模死亡的病原(Bai et al, 2016; Xia et al,2015)?？婪N貝死亡主要發(fā)生在升溫(每天1℃)促熟過程中，當(dāng)水溫升高至18℃左右時(shí)出現(xiàn)死亡；出口加工企業(yè)魁蚶成貝死亡發(fā)生在夏初暫養(yǎng)池水溫達(dá)到13℃左右時(shí)。病死魁蚶普遍出現(xiàn)雙殼閉合不全、爛鰓、出血和內(nèi)臟團(tuán)蒼白等非典型臨床癥狀，死亡率往往達(dá)到100%(Bai et al, 2016)。2017 年，從廣東省深圳市東山碼頭獲取的毛蚶樣本中檢測到高載量的OsHV-1 DNA，但對產(chǎn)地毛蚶種群是否有影響尚不清楚(Gao et al, 2018b)。2019 年，山東萊州育苗企業(yè)從山東、浙江等地引進(jìn)的毛蚶種貝，在產(chǎn)卵前或產(chǎn)卵期間發(fā)生OsHV-1 感染導(dǎo)致的大規(guī)模死亡，發(fā)病時(shí)育苗池水溫約21℃(未發(fā)表數(shù)據(jù))。以上結(jié)果提示，我國養(yǎng)殖的牡蠣等貝類中存在多種對OsHV-1 易感的種類，貝類育苗和養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)該注重防范生產(chǎn)過程中的貝類皰疹病毒病害。

1.2 牡蠣皰疹病毒的全球傳播和分布范圍

與脊椎動物皰疹病毒較強(qiáng)的宿主專一性不同，OsHV-1的宿主范圍較廣，目前已知能感染13種雙殼貝類(圖1)，其中包括牡蠣6種：長牡蠣、歐洲牡蠣(Ostrea edulis)(Comps et al, 1993)、新西蘭牡蠣(Ostrea angasi)(Hine et al, 1997)、智利牡蠣(Ostrea chilensis)(Hine et al, 1998)、福建牡蠣(Crassostrea angulata)和矮牡蠣(Ostrea stentina)(López-Sanmartín et al,2016a)；扇貝3種：櫛孔扇貝(宋微波等, 2001; 王崇明等, 2002)、歐洲大扇貝(Pecten maximus)(Arzul et al,2001a)和海灣扇貝(Argopecten irradians)(Kim et al,2019)；蛤仔2 種：菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)(Renault et al, 2001c)和歐洲蛤仔(Ruditapes decussatus)(Arzul et al, 2001b)；蚶類2 種：魁蚶(Bai et al, 2016)和毛蚶(Gao et al, 2018b)。

圖1 OsHV-1 在全球主要國家和地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)的時(shí)間及感染物種Fig.1 The first occurence of OsHV-1 in major countries and associated mollusks

截止目前，已在全球17 個(gè)國家檢測到OsHV-1感染病例，遍布于非洲和南極洲之外的各大洲。長牡蠣作為養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最大的貝類，也是受OsHV-1 危害最嚴(yán)重的種類，其感染案例在17 個(gè)國家均有分布，而其他貝類品種的感染案例通常只局限于一個(gè)國家。

1.3 鮑皰疹病毒發(fā)現(xiàn)、傳播及對中國鮑養(yǎng)殖業(yè)的危害

皰疹樣病毒粒子感染腹足貝類的案例首次發(fā)現(xiàn)于1999年，引起中國福建東山地區(qū)雜色鮑大規(guī)模死亡，隨后幾年在中國南方雜色鮑養(yǎng)殖區(qū)廣泛傳播(Wang et al, 2004)。病鮑主要表現(xiàn)為攝食量減少、活力下降和黏液分泌增多等非典型癥狀，出現(xiàn)癥狀3～7 d后即發(fā)生大規(guī)模死亡(宋振榮等, 2000)。這也是鮑首次因病毒感染發(fā)生急性死亡的案例，從出現(xiàn)癥狀到大規(guī)模死亡僅3～5 d，致死率高達(dá)95%以上(Wang et al,2004)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，該疫病只發(fā)生在南方水溫較低的季節(jié)，因此被稱為鮑低溫病毒病。但當(dāng)時(shí)因技術(shù)所限，未能進(jìn)一步鑒定該病毒病原，該疫病在我國也被稱為鮑病毒性死亡病。2003和2005年，臺灣地區(qū)養(yǎng)殖雜色鮑和澳大利亞的黑唇鮑(Haliotis rubra)、綠唇鮑(Haliotis laevigata)及其雜交種，分別發(fā)生類似的皰疹病毒引起的急性病毒性大規(guī)模死亡(Chang et al, 2005; Hooper et al, 2007)。病鮑表現(xiàn)的主要病理特征是腹足神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)組織炎癥和細(xì)胞浸潤，因此，該病又被稱為鮑病毒性神經(jīng)炎(Abalone viral ganglioneuritis, AVG)(Hooper et al, 2007)。對感染澳大利亞鮑的皰疹病毒粒子進(jìn)行基因組序列測定和分析，結(jié)果顯示，AVG病原為一種新皰疹病毒，與OsHV-1的親緣關(guān)系較近，ICTV將該病毒命名為鮑皰疹病毒1 (Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1)。

根據(jù)最近開展的回溯性研究，中國南方1999年起發(fā)生的鮑低溫病毒病病原，與臺灣地區(qū)和澳大利亞發(fā)生的AVG病原為同一種病毒，即鮑皰疹病毒(Bai et al,2019a; Wei et al, 2018)。由于HaHV-1的高傳染性和致死率，其在中國南方反復(fù)發(fā)作幾年后，目前中國雜色鮑養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)幾近滅絕。截止目前，只在以上3個(gè)國家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)HaHV-1感染案例，其易感物種除了以上提到的幾種外，還有棕唇鮑(Haliotis conicopora)。研究結(jié)果還證實(shí)，新西蘭黑金鮑(Haliotis iris)與皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)對HaHV-1不敏感(Bai et al,2019a; Corbeil et al, 2017)。

2 軟體動物皰疹病毒的基本特征與株系分化

2.1 軟體動物皰疹病毒的分類地位

軟體動物皰疹病毒與已知感染陸生和水生脊椎動物的皰疹病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2011 年，ICTV 在其發(fā)布的第九次報(bào)告中，將原皰疹病毒科提升為皰疹病毒目(Herpesvirales)，重新設(shè)置3 個(gè)皰疹病毒科，其成員分別感染陸生脊椎動物、水生脊椎動物和無脊椎動物(Davison et al, 2002)(圖2)。其中，軟體動物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae)目前由2 個(gè)屬(Ostreavirus和Aurivirus)組成，每個(gè)屬包含1 個(gè)病毒種，分別為OsHV-1 和HaHV-1 (Minson et al, 2011)。

圖2 皰疹病毒目系統(tǒng)發(fā)育樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖(獲ELSEVIER 出版集團(tuán)授權(quán)刊載)Fig.2 A sketch of the herpesvirus evolutionary tree (Reprinted with permission from Elsevier)

2.2 軟體動物皰疹病毒的結(jié)構(gòu)與基因組特征

軟體動物皰疹病毒核衣殼具有皰疹病毒典型的正二十面體結(jié)構(gòu)，核衣殼內(nèi)是以雙鏈DNA 為核心的遺傳物質(zhì)(圖3)。核衣殼在細(xì)胞核內(nèi)完成裝配，并被運(yùn)出細(xì)胞核，在高爾基體及釋放到胞外過程中完成被膜(Tegument)和囊膜的裝配。有關(guān)OsHV-1 形態(tài)結(jié)構(gòu)的電鏡觀測報(bào)道相對較多，涉及多個(gè)物種，其核衣殼直徑在71～111 nm 之間，裝配好的病毒顆粒直徑為106～153 nm (圖3A) (Arzul et al, 2001a; Bai et al, 2016;Hine et al, 1998; Renault et al, 2000a)。HaHV-1 相關(guān)的研究報(bào)道較少，其核衣殼直徑約為100 nm (圖3B)，僅有1 例報(bào)道觀察到處于細(xì)胞外、完成裝配的病毒粒子，直徑約為165 nm (Corbeil et al, 2012)。僅憑電鏡下病毒的形態(tài)特征不能區(qū)分OsHV-1 和HaHV-1。

OsHV-1 和HaHV-1 基因組大小相似，約為210 kb，但其GC 含量不同，分別為38.7%和46.8% (Davison et al, 2005; Savin et al, 2010)。皰疹病毒的基因組并不是簡單的單一序列，而是由多個(gè)直接或反向重復(fù)序列與數(shù)個(gè)單一序列按不同模式間隔排列組成。根據(jù)排列模式的不同，可以把皰疹病毒基因組分為6 種類型(Roizman et al, 2001)。OsHV-1 的結(jié)構(gòu)模式可以概括為TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS，其中UL和US是單一序列，在參考基因組中的長度分別為167843 和3370 bp，TRL/IRL和TRS/IRS是2 對反向重復(fù)序列，長度分別為9774 和7584 bp，X 也是單一序列，長度為1510 bp(Davison et al, 2005)。利用高通量測序技術(shù)對OsHV-1 微變株(OsHV-1μvar)的深度測序結(jié)果表明，X 區(qū)的測序深度是OsHV-1 基因組其他區(qū)域的2 倍，推測OsHV-1 微變株基因組包含雙拷貝的X 區(qū)，另一個(gè)位于基因組末端。因此，微變株的基因組結(jié)構(gòu)可能是 TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS-X’或 X’-TRL-UL-IRLX-IRS-US-TRS(Abbadi et al, 2018; Burioli et al, 2017)。不同變異株基因組結(jié)構(gòu)單元的長度可能有差異，但其結(jié)構(gòu)模式相似(Ren et al, 2013; Xia et al, 2015)。預(yù)測OsHV-1 基因組編碼124 個(gè)開放閱讀框(Open reading frame, ORF)(Davison et al, 2005)。HaHV-1 的結(jié)構(gòu)模式相對簡單，可以概括為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，預(yù)測編碼110 個(gè)ORFs (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

圖3 OsHV-1 感染魁蚶(A)和HaHV-1 感染雜色鮑(B)細(xì)胞核中觀察到的皰疹樣病毒Fig.3 Viral particles identified in the nuclei of OsHV-1 infected S. broughtonii (A) and HaHV-1 infected H. diversicolor supertexta (B)

2.3 軟體動物皰疹病毒的變異與株系分化

軟體動物皰疹病毒在自然界存在多種變異株，它們的組成和比例不斷演化，以適應(yīng)不斷變化的生態(tài)環(huán)境。目前，研究較多的OsHV-1 變異株有參考株(Davison et al, 2005)、扇貝急性病毒性壞死病毒(AVNV)、微變株(OsHV-1μvar)和魁蚶株(OsHV-1-SB)；其中，參考株和微變株最早都發(fā)現(xiàn)于長牡蠣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)的法國(Davison et al, 2005; Segarra et al, 2010)，AVNV 和OsHV-1-SB 分別來自中國養(yǎng)殖櫛孔扇貝和魁蚶(Bai et al, 2016; Ren et al, 2013)。已公布的OsHV-1 7 個(gè)變異株基因組序列相似性為93.5% (Bai et al, 2019b)，而單純皰疹病毒2 (Herpes simplex virus 2)與單純皰疹病毒1 (Herpes simplex virus 1)的這一比例分別為99.6%和96.8% (Norberg et al, 2007; Szpara et al, 2014)。OsHV-1 不同變異株間相對較低的序列相似度，可能與其和不同宿主長期協(xié)同進(jìn)化過程中發(fā)生較強(qiáng)的株系分化有關(guān)。

基于不同OsHV-1 變異株基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，各變異株以其宿主不同(櫛孔扇貝、長牡蠣和魁蚶)分為3 個(gè)支系，說明宿主范圍在該病毒系統(tǒng)分化過程中占主導(dǎo)地位(Bai et al, 2019b)。在宿主為長牡蠣的病毒支系中，在法國海區(qū)先后發(fā)現(xiàn)的OsHV-1 參考株和微變株之間呈姊妹支關(guān)系，而不是祖先與后代關(guān)系(Segarra et al, 2010; Bai et al, 2019b)。根據(jù)病毒基因組高變異位點(diǎn)序列，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分析了本國或部分區(qū)域內(nèi)OsHV-1 不同變異株的演化和變異規(guī)律(Bai et al, 2015; Batista et al, 2015; Mineur et al,2015; Renault et al, 2012; Shimahara et al, 2012)。對中國2001～2013 年間27 個(gè)海區(qū)貝類樣品OsHV-1 的感染情況、C2/C6 位點(diǎn)序列變異、病毒株系分化及其時(shí)空分布規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中國存在多達(dá)24 種變異株，OsHV-1 種群間存在因地理隔離和時(shí)間推移產(chǎn)生的種群分化(Bai et al, 2015)。基于不同地區(qū)變異株C2/C6 位點(diǎn)多態(tài)性差異等分析結(jié)果，Mineur 等(2015)推測，OsHV-1 起源于亞洲地區(qū)，伴隨長牡蠣引種傳播到全球各地，但目前這一假說尚未得到更多數(shù)據(jù)的支撐。目前，OsHV-1 的起源和全球傳播過程還不清楚，現(xiàn)有結(jié)果表明，OsHV-1 是一個(gè)古老的皰疹病毒支系，已與其天然宿主經(jīng)過長期的協(xié)同演化過程。自然界存在多個(gè)OsHV-1 變異株，近年來在貝類高密度養(yǎng)殖、脫離原有生境等的應(yīng)激壓力下，OsHV-1 病害相繼發(fā)生。

法國開展的OsHV-1 分子流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示，OsHV-1 新變異株的不斷出現(xiàn)給貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅。例如，OsHV-1 最初在法國暴發(fā)時(shí)致病力較弱，雖然造成的長牡蠣幼蟲死亡曾引起苗種短缺，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成不利影響，但法國長牡蠣年產(chǎn)量僅小幅下挫，從1991 年的12.9 萬t 跌至2007 的11.1 萬t (FAO 漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。2008 年，法國開始大范圍流行致病力更強(qiáng)的微變株(OsHV-1μvar)，主要引起海區(qū)養(yǎng)殖稚貝和幼貝的大規(guī)模死亡，導(dǎo)致近年來法國長牡蠣年產(chǎn)量跌至6.4 萬t (FAO 漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。這些結(jié)果提示，未來應(yīng)加強(qiáng)OsHV-1 的分子流行病學(xué)監(jiān)測，及時(shí)評估和應(yīng)對新變異株對中國貝類養(yǎng)殖業(yè)造成的威脅。

HaHV-1 株系分化和分子流行病學(xué)的相關(guān)研究還很欠缺，根據(jù)其地理分布分為中國大陸株、臺灣株和澳大利亞株，它們基因組序列間的相似度為91.5%(Bai et al, 2019c; Chen et al, 2016; Savin et al, 2010)。已知的HaHV-1 易感宿主都來自Haliotis 屬，均引起宿主的急性感染和死亡。然而，2009 年起，臺灣地區(qū)發(fā)生皰疹病毒引起的雜色鮑慢性死亡案例，死亡可從早春一直持續(xù)到秋季，累計(jì)死亡率達(dá)80%左右，成為臺灣鮑養(yǎng)殖業(yè)面臨的主要疫病(Chen et al, 2016)?；贖aHV-1 基因組設(shè)計(jì)的20 對引物，均不能從慢性死亡鮑樣本中擴(kuò)增出條帶，推測引起鮑慢性死亡的皰疹病毒與HaHV-1 基因組序列相似度很低，其與HaHV-1 的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究(Chen et al, 2016)。

3 軟體動物皰疹病毒感染的致病特征

3.1 病理特征

OsHV-1 感染的病理變化廣泛分布于各主要器官的結(jié)締組織，如外套膜、鰓、肝胰腺和生殖腺等，病變組織內(nèi)常伴有以染色質(zhì)邊集和核固縮為特征的異常細(xì)胞核(Renault et al, 2000a; Segarra et al, 2016)。常見的受感染細(xì)胞類型有成纖維細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞，偶爾也能觀察到感染的神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞(Lipart et al,2002; Segarra et al, 2016; Xin et al, 2018)。利用原位雜交技術(shù)在發(fā)病牡蠣生殖腺中還觀察到被病毒DNA 探針標(biāo)記的感染細(xì)胞，部分細(xì)胞鑒定為卵母細(xì)胞(Corbeil et al, 2015)，從分離的卵細(xì)胞和精細(xì)胞中檢測到病毒DNA，推測OsHV-1 存在垂直傳播的可能性(López-Sanmartín et al, 2016b)。另外，在部分歐洲牡蠣(Comps et al, 1993)和新西蘭牡蠣(Hine et al, 1997)感染案例中，觀察到核內(nèi)Cowdry type A 型包涵體，但未在包括長牡蠣在內(nèi)的其他貝類中發(fā)現(xiàn)包涵體(Arzul et al, 2017)。

HaHV-1 澳大利亞株和臺灣株感染的組織病變集中在中樞神經(jīng)組織，而引起鮑慢性死亡的皰疹病毒主要感染血淋巴細(xì)胞，并造成結(jié)締組織損傷和血細(xì)胞浸潤(Chen et al, 2016)。Bai 等(2020)基于組織病理和原位雜交的分析結(jié)果顯示，HaHV-1 大陸株感染不僅引起雜色鮑足神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)組織病變，在外周神經(jīng)組織、感染后期的外套膜、肝胰腺等器官的結(jié)締組織也出現(xiàn)病變和病毒探針標(biāo)記的感染細(xì)胞；利用透射電鏡，還在感染的鮑血淋巴細(xì)胞中觀察到皰疹樣病毒粒子。目前，HaHV-1 中國大陸與臺灣株、澳大利亞株組織親嗜性差異的原因還不清楚，我們推測與宿主和病原如下兩方面的差異相關(guān)，一是由HaHV-1 不同地理種群株系分化導(dǎo)致的致病性差異，二是宿主品種或品系差異引起組織器官易感性不同。

3.2 疫病發(fā)生和流行規(guī)律

溫度是影響OsHV-1 與HaHV-1 感染強(qiáng)度，發(fā)病與否和危害程度的關(guān)鍵環(huán)境因子(Arzul et al, 2017)，但2 種病毒對溫度的響應(yīng)模式相反：OsHV-1 感染在水溫上升到某個(gè)閾值的高溫季節(jié)發(fā)病，HaHV-1 感染在水溫下降到某個(gè)閾值的低溫季節(jié)發(fā)病。OsHV-1 感染發(fā)病的溫度閾值大小受變異株和宿主物種的共同影響，如OsHV-1 參考株(2008 年之前)感染長牡蠣在21.5℃～26.8℃之間時(shí)發(fā)病(Sauvage et al, 2009)，OsHV-1μvar (2008 年之后)感染長牡蠣在 15.5℃～23.8℃之間時(shí)發(fā)病(Pernet et al, 2012; Petton et al,2015)，櫛孔扇貝在23℃以上時(shí)發(fā)病(宋微波等, 2001;王崇明等, 2002)，魁蚶在14℃以上時(shí)發(fā)病(Xin et al,2020)。不同的海區(qū)環(huán)境(如維度、理化因子等)也會影響溫度閾值。近年來，法國及歐洲養(yǎng)殖長牡蠣發(fā)病的溫度閾值一般為16℃，而澳大利亞養(yǎng)殖長牡蠣發(fā)病的溫度閾值一般是21℃ (de Kantzow et al, 2019)。除溫度之外，其他環(huán)境因子也對OsHV-1 疫病產(chǎn)生影響，如鹽度(Fuhrmann et al, 2018、2016)、環(huán)境微生物(Azema et al, 2016; Pathirana et al, 2019)、餌料豐度(Pernet et al, 2019b)和pH 值(Fuhrmann et al, 2019)等。但這類環(huán)境因子對OsHV-1 疫病的影響效應(yīng)不如溫度直接和明確。溫度主要通過控制病毒是否進(jìn)入指數(shù)復(fù)制期發(fā)揮作用，其效應(yīng)更加明顯和可預(yù)測；其他環(huán)境因子主要通過與宿主間復(fù)雜的相互作用發(fā)揮作用，其對疫病發(fā)生和進(jìn)程的影響表現(xiàn)出明顯的地區(qū)特異性(Fleury et al, 2020; Pernet et al, 2019b)。

Oden 等(2011)對病毒感染長牡蠣的研究結(jié)果顯示，OsHV-1 感染是否引發(fā)宿主的發(fā)病和死亡主要取決于病毒在宿主體內(nèi)的拷貝數(shù)，如果病毒拷貝數(shù)超過8.8×103個(gè)/mg 組織，則會發(fā)病和死亡，否則通常以無癥狀感染的形式長期存在。除櫛孔扇貝、魁蚶、毛蚶和新西蘭牡蠣之外，OsHV-1 感染引發(fā)的病亡主要發(fā)生于幼蟲和稚貝階段。對長牡蠣、福建牡蠣等的流行病學(xué)監(jiān)測結(jié)果顯示，其成貝往往不表現(xiàn)任何臨床癥狀，體內(nèi)病毒感染量也多在103個(gè)/mg 組織以下，這些無癥狀的成貝就成為OsHV-1 在自然界中的天然“蓄水池”，且存在將病毒經(jīng)垂直傳播給下一代的可能(Barbosa-Solomieu et al, 2005; López-Sanmartín et al,2016b)。目前，尚無證據(jù)顯示HaHV-1 感染也表現(xiàn)類似的對宿主發(fā)育階段的偏好性。

Paul-Pont 等(2013b)對澳大利亞Botany 灣OsHV-1致死病例的空間分布規(guī)律研究顯示，牡蠣發(fā)病呈聚集性“斑塊”狀分布，斑塊大小在幾個(gè)閥架至數(shù)公里不等，斑塊的空間分布主要與牡蠣月齡和灣內(nèi)洋流方向相關(guān)。Paul-Pont 等推測，OsHV-1 的水平傳播方式主要是粘附于水中的浮游生物，依賴洋流傳播。

4 軟體動物皰疹病毒診斷方法

4.1 傳統(tǒng)診斷技術(shù)

組織病理和透射電鏡檢測作為傳統(tǒng)的貝類疫病診斷技術(shù)，已被應(yīng)用到軟體動物皰疹病毒的診斷工作中。OsHV-1 感染的診斷可以取外套膜、肝胰腺和鰓等組織器官，HaHV-1 感染診斷須首先小心對鮑腹足進(jìn)行縱切，而后取足神經(jīng)節(jié)進(jìn)行檢測(Mark et al,2016)。歐盟貝類病害參考實(shí)驗(yàn)室提供了詳細(xì)的樣本處理、檢測操作規(guī)程。在光鏡下觀察，若雙殼貝類樣本結(jié)締組織出現(xiàn)大量細(xì)胞浸潤，其中的成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)邊集或核濃縮等細(xì)胞病變，則為疑似OsHV-1 感染。若鮑樣本足神經(jīng)節(jié)和中樞神經(jīng)組織出現(xiàn)病變，則為疑似HaHV-1 感染。組織病理變化不是特異性的，因此不能用于確診。透射電鏡下，細(xì)胞核內(nèi)觀察到皰疹樣病毒粒子，可判定檢測結(jié)果為陽性；但這種檢測不是種特異性的，需要結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，做出最后確診。

4.2 現(xiàn)代診斷技術(shù)

4.2.1 基于PCR 法的診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)診斷技術(shù)以其高敏感性、高特異性和快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，已成為包括貝類在內(nèi)眾多水產(chǎn)動物病原常用的檢測技術(shù)。法國學(xué)者首先設(shè)計(jì)了OsHV-1 巢式PCR檢測用引物(A3/A4 和A5/A6)(Renault et al, 2000b)，但很快被檢測靈敏度更高的普通 PCR 檢測引物(C2/C6)所取代(Renault et al, 2001a)。隨后，多種OsHV-1 檢測用PCR 引物相繼報(bào)道，但多數(shù)引物的檢測靈敏度和特異性未得到充分驗(yàn)證，C2/C6 仍是目前應(yīng)用最廣泛的普通PCR 引物(Batista et al, 2007)。實(shí)時(shí)定量PCR 檢測憑借其可對感染量進(jìn)行精確測定的優(yōu)勢，近年來越來越多的被應(yīng)用到涉及OsHV-1 檢測的各種研究項(xiàng)目中。目前，常用的OsHV-1 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測方法有2 種，分別是使用C9/C10 的SYBR Green 法和使用 OsHV1BF/B4 引物及對應(yīng)探針的TaqMan 探針法(Martenot et al, 2010; Pepin et al,2008)。對HaHV-1 檢測方法的研究相對較少，但也有比較成熟的普通PCR 和實(shí)時(shí)定量PCR 檢測方法可供使用(Mark et al, 2016)。

4.2.2 原位雜交診斷技術(shù) 原位雜交技術(shù)具有細(xì)胞定位能力準(zhǔn)確、特異性好和敏感度高等優(yōu)點(diǎn)。OsHV-1和HaHV-1原位雜交檢測均使用地高辛標(biāo)記探針。OsHV-1檢測有3種大小相似的探針可供選擇，分別由3 對引物(A5/A6、C1/C6 和C2/C6)擴(kuò)增產(chǎn)生(Corbeil et al, 2015; Lipart et al, 2002)；HaHV-1檢測一般使用ORF66F/R引物合成探針(Mark et al, 2016)。另外，Corbeil等(2015)開發(fā)了一種可以檢測OsHV-1 3個(gè)病毒RNA(ORF7、25和87)原位表達(dá)情況的探針雜交技術(shù)。

4.2.3 其他分子診斷技術(shù) 除了上述實(shí)驗(yàn)室常用的診斷技術(shù)外，中國研究人員還基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和熒光定量重組酶聚合酶擴(kuò)增(Quantitative recombinase polymerase amplification, qRPA)技術(shù)，開發(fā)了OsHV-1和HaHV-1 的檢測方法(Chen et al, 2014; Gao et al,2018a、b; Ren et al, 2010)，這些檢測技術(shù)具有更加簡便、快捷、適合現(xiàn)場應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。

5 軟體動物皰疹病毒病的防控

貝類養(yǎng)殖多在開放式海區(qū)進(jìn)行，很多涉及藥物的預(yù)防和治療措施無法施展，給包括軟體動物皰疹病毒病在內(nèi)多種貝類疫病的防控帶來困難。為此，針對軟體動物皰疹病毒，特別是OsHV-1 的生物學(xué)特性、發(fā)病規(guī)律、抗病品系選育等方面開展了大量研究，研發(fā)相關(guān)防控措施(Barbosa-Solomieu et al, 2015)。但HaHV-1 的相關(guān)研究還較少，對該疫病的防控主要依靠劃定病毒污染區(qū)、限制鮑及相關(guān)物品的跨區(qū)流動等基本生物安保措施(Mark et al, 2016)。本節(jié)主要介紹OsHV-1 相關(guān)防控措施的研究進(jìn)展。

5.1 OsHV-1 生物學(xué)特征及室內(nèi)消殺措施

貝類的室內(nèi)養(yǎng)殖一般發(fā)生在育苗階段，OsHV-1流行早期(2008 年之前)的多數(shù)案例是育苗場幼蟲的死亡。對OsHV-1 生物學(xué)特征的研究結(jié)果顯示，在室內(nèi)20℃情況下，OsHV-1 可在海水和死亡牡蠣內(nèi)臟團(tuán)中分別存活2 d 和7 d，并仍保持感染能力，給病毒的徹底消殺工作造成一定困難(Hick et al, 2016)。有利的一點(diǎn)是，OsHV-1 作為一種具有脂質(zhì)囊膜的病毒，在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中屬于比較容易殺滅的病原體。高溫(50℃，5 min)、化學(xué)消毒劑(如10%福爾馬林，30 min)、臭氧和紫外線對該病毒均有較好的殺滅作用(Evans et al, 2016; Hick et al, 2016)。由于成貝往往處于隱性感染狀態(tài)，有可能作為傳染源被引入育苗場。為了預(yù)防此類事件的發(fā)生，研究人員建議對進(jìn)場前的成貝進(jìn)行熱應(yīng)激(水溫升至21℃) 2～3 周，以便使成貝體內(nèi)潛伏感染的OsHV-1 激活和復(fù)制，而后進(jìn)行PCR 檢測，排除潛伏感染成貝帶來的威脅(Hine et al, 1997;Pernet et al, 2015)。

我國部分鮮活貝類上市或出口前需在室內(nèi)暫養(yǎng)數(shù)周，此時(shí)養(yǎng)殖密度高，容易暴發(fā)流行病和大規(guī)模死亡。根據(jù)軟體動物皰疹病毒感染的發(fā)生受溫度調(diào)控這一特點(diǎn)，可通過控制水溫預(yù)防疫病的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)實(shí)踐均表明，水溫控制在10℃及以下可有效防止魁蚶暫養(yǎng)階段發(fā)生OsHV-1 感染。但值得注意的是，不同物種感染軟體動物皰疹病毒后發(fā)病的溫度閾值可能不同，需要通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)確定。

5.2 開放海區(qū)OsHV-1 病害的綜合防控

5.2.1 養(yǎng)殖措施的改善 在法國地中海沿岸，相對開放海區(qū)OsHV-1 疫病死亡率低于灣內(nèi)，插樁式養(yǎng)殖低于吊籃式養(yǎng)殖(Pernet et al, 2012)。澳大利亞和法國開展的研究均表明，增加潮間帶養(yǎng)殖閥架的高度(30～60 cm)可有效降低成貝的OsHV-1 感染率、感染強(qiáng)度和死亡率(Paul-Pont et al, 2013a)。引起這一現(xiàn)象的機(jī)制尚不清楚，推測可能是增加養(yǎng)殖閥架高度后，減少了牡蠣浸水和接觸病毒的時(shí)間(Paul-Pont et al,2013a; Petton et al, 2015)。但這項(xiàng)措施也會減少牡蠣攝食時(shí)間，從而導(dǎo)致生長緩慢、甚至應(yīng)激反應(yīng)(Pernet et al, 2019a)。因此，在水文環(huán)境復(fù)雜、養(yǎng)殖方式多樣的開放式海區(qū)，養(yǎng)殖措施的改良應(yīng)充分考慮苗種來源(人工苗或野生苗)、遺傳背景、繁殖周期和月齡等因素(Evans et al, 2019; Ugalde et al, 2018)；很難形成一套適合所有海區(qū)的OsHV-1 防控技術(shù)規(guī)程，也很難依靠單一技術(shù)實(shí)現(xiàn)OsHV-1 病害的有效防控(Fleury et al,2020)。遵循“因地制宜、多管齊下”的策略，才能通過養(yǎng)殖措施的優(yōu)化緩解OsHV-1 給貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來的危害。例如，西班牙埃布羅河三角洲地區(qū)受OsHV-1疫情的影響，長牡蠣年產(chǎn)量從2006 年的800 t 縮減到2011 年的138 t (Carrasco et al, 2017)。當(dāng)?shù)赝ㄟ^改良生產(chǎn)周期、避開危險(xiǎn)期投放稚貝苗種，控制投苗規(guī)格，降低養(yǎng)殖密度和優(yōu)化生產(chǎn)管理方法等一系列措施，使當(dāng)?shù)啬迪狆B(yǎng)成期死亡率從2015 年之前的約80%，下降到2015 年及之后的2%～7.5% (Carrasco et al, 2017)。

5.2.2 抗病品系選育 對長牡蠣和魁蚶的研究表明，天然存在對OsHV-1 不敏感的家系，這為抗病品系選育提供了自然資源(Bai et al, 2017; Dégremont et al, 2005)。我們開展的感染實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)數(shù)據(jù)顯示，韓國來源的魁蚶對OsHV-1 普遍不敏感，近年來多被中國魁蚶育苗企業(yè)選為種貝。對15 個(gè)長牡蠣家系的感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人工感染14 d 后的成活率各不相同，范圍在0～97.4%之間(de Lorgeril et al, 2018)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，長牡蠣表現(xiàn)出較高的抗OsHV-1 加性遺傳變異，遺傳力大小在0.12～0.63 之間(Azema et al, 2015; Camara et al, 2017; Dégremont et al,2015)。目前，法國、英國和新西蘭等均已啟動各自的抗OsHV-1 長牡蠣選育項(xiàng)目，法國通過對不同長牡蠣家系連續(xù)4 代的大規(guī)?？共《具x育，使3～6 月齡牡蠣的成活率提高7%～63% (Dégremont et al, 2015)。

6 結(jié)論與展望

中國的貝類養(yǎng)殖規(guī)模大、種類全，目前在養(yǎng)的貝類約80 種，發(fā)揮著重要的食物供給和生態(tài)服務(wù)功能(唐啟升等, 2016)。進(jìn)入21 世紀(jì)，貝類的高密度養(yǎng)殖模式和人工苗種繁育技術(shù)得以廣泛推廣(唐啟升等,2013; 闕華勇等, 2016)，在推動養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷提升的同時(shí)，也導(dǎo)致傳染性病害頻繁發(fā)生，使中國貝類養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。已開展的軟體動物皰疹病毒相關(guān)研究使我們對貝類病毒病有了更深入的認(rèn)識，但仍存在很多知識盲區(qū)，如病毒結(jié)構(gòu)蛋白的組成和功能、入侵和致病機(jī)制等對病毒病防控至關(guān)重要的基礎(chǔ)科學(xué)問題(張奇亞等, 2014)；變異株鑒別診斷及其在中國海區(qū)的分布范圍和流行規(guī)律等，與疫病有效防控息息相關(guān)的基本信息也尚未掌握。

當(dāng)前，中國貝類養(yǎng)殖業(yè)尚缺乏生物安保(Biosecurity)理念指導(dǎo)下的疫病風(fēng)險(xiǎn)管理和應(yīng)對策略(黃倢等,2016)。在此背景下的苗種跨區(qū)轉(zhuǎn)運(yùn)、南北接力養(yǎng)殖等，都有可能導(dǎo)致病原微生物的傳播，威脅貝類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。在貝類主產(chǎn)區(qū)建立貝類疫病預(yù)警系統(tǒng)(宋林生, 2020)，引入生物安保概念，提高生物安保意識，貫徹和落實(shí)生物安保指導(dǎo)下的健康養(yǎng)殖理念(黃倢等, 2016)，才能實(shí)現(xiàn)軟體動物皰疹病毒等貝類疫病的有效防控。