腫瘤組織中細(xì)胞間粘附分子-1表達(dá)的PET/近紅外熒光跨模態(tài)靶向成像表征

李 淼，BARNHART Todd E，ENGLE Jonathan W

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，陜西 西安710061；2威斯康星大學(xué)麥迪遜分校醫(yī)學(xué)物理系，美國麥迪遜53705

細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）是一種跨膜糖蛋白，可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、胞外基質(zhì)之間的識別和粘附，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移［1-2］。ICAM-1的生理性表達(dá)水平較低，在乳腺癌、甲狀腺癌組織中已被證實高表達(dá)?；诖吮磉_(dá)差異的臨床前靶向成像研究已見報道［3-4］。有報道稱，胰腺癌組織相對于正常或胰腺炎組織也高表達(dá)ICAM-1［5-6］。胰腺癌是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤。其早期癥狀隱匿，確診時分級普遍偏高，病死率接近發(fā)病率［7-8］。由于手術(shù)是胰腺癌唯一可能的根治手段，而術(shù)后常見病灶殘留及轉(zhuǎn)移［9］，故準(zhǔn)確定位病灶顯得尤為重要［10］。臨床上常用于檢測胰腺癌的血清學(xué)標(biāo)志物（糖抗原CA19-9、癌胚抗原CEA等），其靈敏度雖高，但無法給出病灶的解剖定位［11-13］；傳統(tǒng)影像學(xué)手段雖能反映解剖定位，但只能給出物理信息，難以描述細(xì)微生物學(xué)改變，組織特異性不足［9］。已知分子影像學(xué)方法可選擇性、全身、無創(chuàng)、實時監(jiān)測。但臨床常用于胰腺癌的葡萄糖代謝類、乏氧靶向類傳統(tǒng)分子影像示蹤劑屬于小分子化合物、配體或底物，其靶組織特異性或濃聚程度尚不理想［14］。胰腺癌組織高表達(dá)ICAM-1，提示針對ICAM-1進(jìn)行胰腺癌靶向成像或治療不僅具有潛在臨床價值，也具有可行性［6,15］。為克服前述傳統(tǒng)示蹤劑的不足，本研究擬基于具備高度特異性和親和力的、針對ICAM-1的單克隆抗體（簡稱單抗）構(gòu)建靶向示蹤劑［16］。通過在單一靶向分子上標(biāo)記熒光團(tuán)/核素雙標(biāo)簽制備示蹤劑，分別用于近紅外熒光（NIRF）和正電子發(fā)射斷層（PET），以期獲得較好的靶/非靶組織成像對比度。本研究提出采用跨模態(tài)對照成像表征胰腺癌組織中ICAM-1的表達(dá)情況這一新策略，旨在為腫瘤病灶的術(shù)前全身無創(chuàng)定位，以及為后續(xù)術(shù)中導(dǎo)航等臨床應(yīng)用提供有價值的跨模態(tài)融合成像技術(shù)路線，以期有助于改善治療決策或患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠抗人ICAM 1 單抗（克隆號R6-5-D6；BioXCell）；1-（4-異硫氰酸苯基）-3-[6,17-二羥基-7,10,18,21-四氧-27-（N-乙酰羥胺）-6,11,17,22-四氮雜七烷二酮]硫脲，即p-SCN-去鐵胺（Df）；NIRF染料800 CW-N-羥基琥珀酰亞胺基酯（800 CW-NHS）；AlexaFluor488標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（BioLegend）；Pharmingen大鼠抗小鼠CD31抗體（BD）；Cy3標(biāo)記驢抗大鼠抗體（Jackson Immuno Research）；非特異性人源IgG 對照品（Invitrogen）；PD-10脫鹽柱（GE醫(yī)療）；超濾膜（相對分子 質(zhì) 量 閾 值30 000；Life Technologies）；基 質(zhì) 膠（Gemini Bio-products）；超純濃鹽酸（Mallinckrodt）；溶于Vectashield介質(zhì)的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和其他試劑（ThermoFisher公司）。

1.2 熒光團(tuán)和配合體耦聯(lián)

通過抗體賴氨酸殘基上的氨基分別與Df上的異硫氰酸酯基、800 CW-NHS 上的酯基進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)，以及通過放射性配位反應(yīng)，來制備雙標(biāo)記ICAM-1單抗示蹤劑。將Df 的二甲基亞砜溶液（10 μL）加入ICAM-1 單抗的磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）1×/碳酸（氫）鈉緩沖液（0.1 moL,pH 9.2）混合液（體積比1∶1，合計300 μL），Df與ICAM-1單抗的摩爾比為10∶1；室溫振蕩反應(yīng)2 h；以PBS 1×為流動相，過PD-10柱純化出Df-ICAM-1單抗產(chǎn)物，超濾（13 000×g）濃縮至500 μL；將5 μg 800 CW-NHS溶于無水二甲基亞砜（100 μL）制備儲備液；將800 CW-NHS儲備液和Df-ICAM-1單抗溶液（3 mg/mL，50 μL）加入PBS 1×/碳酸（氫）鈉緩沖液的混合液（體積比1∶1，合計300 μL）；Df-ICAM-1單抗與800 CW-NHS的摩爾比為1∶2，室溫避光振蕩反應(yīng)2 h；過PD-10柱純化出產(chǎn)物800 CW/Df-ICAM-1單抗，超濾濃縮至150 μL。

1.3 核素制備

[89Zr]鋯采用PETtrace回旋加速器（GE）通過核反應(yīng)89Y（p,n）89Zr制備。采用能量為16.4 MeV、強(qiáng)度5 mA的質(zhì)子束流轟擊[89Y]釔箔（厚度250 μm，純度99.9%）2 h；將[89Y]釔箔溶于超純濃鹽酸，溶解液載入羥胺酸修飾樹脂色譜柱；6 N鹽酸淋洗，產(chǎn)物[89Zr]鋯離子采用1 M草酸洗脫，收集草酸[89Zr]鋯餾分。

1.4 核素標(biāo)記

草酸[89Zr]鋯溶于HEPES緩沖液（500 μL,0.5 moL,pH 7.0），用1 mol/L碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5；將800 CW/Df-ICAM-1單抗加入反應(yīng)體系（100 μg/mCi）；37 ℃下恒溫震蕩（700 r/min）反應(yīng)1 h；過PD-10柱純化出800 CW/89Zr-Df-ICAM-1單抗（簡稱示蹤劑）餾分，過0.22 μm濾膜除菌。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

人源胰腺癌細(xì)胞系（BxPC-3、MIA PaCa）用RPMI 1640培養(yǎng)基（含高糖、10%胎牛血清），通入5%CO2氣體，加濕，37 ℃恒溫培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%的面積時，消化收集用于后續(xù)測定和接種。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測定

BxPC-3、MIA PaCa細(xì)胞系的ICAM-1表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)（簡稱流式）測定。將細(xì)胞懸浮于預(yù)冷流式緩沖液均分成多管（約1.5×106個細(xì)胞/管）；封閉后分別與預(yù)冷PBS 1×（作空白對照）、山羊抗小鼠抗體（作二抗對照，終濃度5 μg/mL）、ICAM-1 單抗和800 CW/Df-ICAM-1單抗（分別作一抗，終濃度均為5 μg/mL）在冰上孵育1 h；被ICAM-1單抗和800 CW/Df-ICAM-1單抗染色的細(xì)胞用預(yù)冷PBS 1×洗滌后，與山羊抗小鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在冰上避光反應(yīng)1 h；每個樣品里的細(xì)胞分別重懸于預(yù)冷PBS 1×（300 μL），采用LSR Fortessa流式細(xì)胞儀（BD）測定。數(shù)據(jù)采用FlowJo軟件分析。

1.7 皮下異種移植瘤小鼠模型構(gòu)建

所有動物操作符合當(dāng)?shù)毓俜胶退趩挝坏膭游飩惱硪?guī)范。動物模型全部采用4～5周齡雌性無胸腺裸鼠（Envigo）構(gòu)建。接種前將細(xì)胞重懸于預(yù)冷PBS 1×并與基質(zhì)膠混合（體積比1∶1），置于冰上暫存；細(xì)胞懸液注射于右后肢皮下（5×106細(xì)胞/只）。腫瘤直徑達(dá)到5～10 mm時用于活體研究。

1.8 活體PET/NIRF成像和離體放射性生物分布

給模型鼠經(jīng)尾靜脈注射5～10 MBq（0.14～0.27 mCi）示蹤劑后，在預(yù)設(shè)時點（4、24、48、72、96、120 h）相繼進(jìn)行跨模態(tài)成像。采用Inveon 小動物PET/CT 掃描儀（Siemens）進(jìn)行PET成像：模型鼠取俯臥位置于PET掃描床上；5～15 min 靜態(tài)模式采集，無衰減/散射校正；OSEM3D算法重建；各器官感興趣區(qū)（ROI）在Inveon Research Workstation（Siemens）軟件上手動勾劃；ROI定量攝取值記錄為%ID/g。在腫瘤PET ROI攝取值達(dá)峰時點，模型鼠完成PET 掃描后，立即移入IVIS Spectrum 成像儀（PerkinElmer）進(jìn)行NIRF 成像：取俯臥位以更好暴露病灶位置；NIRF 激發(fā)/發(fā)射波長為745 nm/800 nm；其他參數(shù)為IVIS系統(tǒng)默認(rèn)值。

NIRF成像后立即處死小鼠并解剖。采集血液、主要器官和腫瘤組織，稱重；各組織樣本放射性計數(shù)用Wizard 2480 γ計數(shù)器（PerkinElmer）測定，換算為%ID/g值。

1.9 組織器官離體NIRF成像

另取BxPC-3 模型鼠注射示蹤劑。在腫瘤PET ROI攝取值達(dá)峰時點，將模型鼠窒息處死，取俯臥位，立即進(jìn)行全身白光明場照相和NIRF成像；剖開右后肢皮膚，暴露瘤體；切除腫瘤前后，再分別進(jìn)行全身及瘤體的白光明場照相和NIRF成像，參數(shù)同上一節(jié)。

1.10 免疫組織化學(xué)

瘤塊采集后立即冷凍切片（厚度5 μm）；浸入預(yù)冷丙酮中固定10 min；室溫放置3 min 風(fēng)干；室溫封閉30 min 后，切片與作為一抗的ICAM-1 單抗（終濃度10 μg/mL）在4 ℃共孵育過夜；切片與作為二抗的AlexaFluor488標(biāo)記山羊抗小鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在室溫共孵育1 h；取毗鄰切片與作為一抗的大鼠抗小鼠CD31 抗體（終濃度10 μg/mL）在4 ℃孵育過夜，然后切片與作為二抗的Cy3標(biāo)記驢抗大鼠抗體（終濃度5 μg/mL）在室溫孵育1 h；所有切片滴加DAPI浸潤后加載蓋玻片封片。在A1R共聚焦顯微鏡（Nikon）上觀察。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均值的比較采用Student's t-檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌細(xì)胞系ICAM-1表達(dá)

BxPC-3與MIA PaCa細(xì)胞系的ICAM-1表達(dá)水平有顯著差異，前者表達(dá)水平更高（圖1）。經(jīng)800 CW-和Df-基團(tuán)修飾的ICAM-1單抗（即800 CW/Df-ICAM-1單抗）作一抗時，在上述2種細(xì)胞系中表現(xiàn)出來的熒光信號強(qiáng)度，與采用ICAM-1單抗作一抗時相似。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)測定的胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）表達(dá)Fig.1 Expression of ICAM-1 in pancreatic cancer cell lines detected by flow cytometry.

2.2 熒光團(tuán)耦聯(lián)及核素標(biāo)記產(chǎn)物

在800CW-NHS 與Df-ICAM-1 單抗的耦聯(lián)反應(yīng)中，本研究選用了已經(jīng)過驗證的單抗-熒光團(tuán)分子投料摩爾比（1∶2），以避免熒光團(tuán)在單抗分子上耦聯(lián)過于密集誘發(fā)自淬滅現(xiàn)象［17］。示蹤劑終產(chǎn)物比活度為9.8±1.4 mCi（362.69±51.8 MBq/mg，n=6），未經(jīng)衰減校正的[89Zr]鋯標(biāo)記反應(yīng)放射化學(xué)產(chǎn)率＞70%。

2.3 活體PET/NIRF成像和離體放射性生物分布

PET成像結(jié)果（圖2）顯示，在BxPC-3模型鼠中的腫瘤攝取值在示蹤劑注射后24 h達(dá)峰（10.9±2.0%ID/g），之后隨時間推移緩慢下降。在MIA PaCa模型鼠中，示蹤劑注射后，腫瘤攝取值緩慢上升，在24 h到達(dá)平臺期5.5±1.0%ID/g，并從96 h開始輕微下降?？梢娫跀z取值峰值上，BxPC-3 腫瘤顯著高于MIA PaCa 腫瘤（P＜0.05）。2種模型鼠的其他器官，攝取值動力學(xué)曲線走勢相似，其中肝、脾都有較高生理性攝取。離體放射性生物分布研究顯示，示蹤劑注射后120 h的生物分布攝取值與PET ROI攝取值基本一致（圖3）。2種模型鼠在示蹤劑注射24 h后的典型PET和NIRF對比成像中（圖4）。

縱軸為每克組織注射劑量占比（%ID/g）；橫軸為示蹤劑注射后時點；A：BxPC-3組（n=3）；B：MIA PaCa組（n=4）；P＜0.05。

2.4 組織器官離體NIRF成像

組織器官離體NIRF成像研究結(jié)果示，解剖及瘤體切除前后，BxPC-3移植瘤體的位置和邊界在白光明場視圖和NIRF視圖之間能準(zhǔn)確匹配（圖5）。瘤體移除后，NIRF信號從接種位點完全轉(zhuǎn)移到瘤體，原接種位點幾乎無殘留信號。

2.5 免疫組織化學(xué)研究

熒光共聚焦顯微成像顯示（圖6），BxPC-3腫瘤組織有強(qiáng)ICAM-1信號，而MIA PaCa腫瘤組織的ICAM-1信號弱。ICAM-1信號與腫瘤細(xì)胞周圍位置重疊，與細(xì)胞核（DAPI）或血管（CD31）信號未見重疊。CD31信號分布在2種腫瘤組織中大致相當(dāng)。

圖2 胰腺癌模型鼠正電子發(fā)射斷層成像感興趣區(qū)攝取值動力學(xué)曲線Fig.2 Uptake kinetics of region of interest(ROI)in positron emission tomography (PET) images of mouse models of pancreatic cancer.

圖3 示蹤劑在胰腺癌模型鼠各組織器官的放射性生物分布（BxPC-3和MIAPaCa）Fig.3 Radioactive bio-distribution of the tracer in tumors and major organs of mouse models of pancreatic cancer (BxPC-3 and MIAPaCa).

3 討論

ICAM-1可被視為經(jīng)典胰腺癌成像靶標(biāo)（整合素αvβ6、CEA、CA19-9等）之外的新型靶標(biāo)［14,18-20］。已有報道將拉曼光成像、超聲成像、磁共振成像和單光子發(fā)射斷層成像（SPECT）用于胰腺癌ICAM-1成像。盡管這些模態(tài)肯定了ICAM-1用作胰腺癌成像靶標(biāo)的可行性，但其靈敏度和定量能力無法媲美本文所采用的PET［3,21-24］。不論在PET還是NIRF模態(tài)，本文中的BxPC-3腫瘤與MIA PaCa腫瘤都顯示出強(qiáng)烈視覺差異。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也確認(rèn)，不同胰腺癌組織中ICAM-1的表達(dá)差異與前述PET/NIRF 成像和生物分布研究結(jié)果相吻合。這說明本文所構(gòu)建的示蹤劑，針對胰腺癌組織具有優(yōu)越的體內(nèi)靶向性和靶組織親和力，本文所采用的PET/NIRF跨模態(tài)成像策略具備優(yōu)良性能。

光學(xué)成像是最適合術(shù)中導(dǎo)航的模態(tài)［25］，尤其是NIRF（700～900 nm），原因包括：（1）避開生物分子吸收光譜，背景干凈；（2）可見光譜內(nèi)的組織自發(fā)熒光比常規(guī)染料熒光團(tuán)低；（3）相比其他波長的光，組織穿透性更好；（4）商品化試劑和成像儀器成本低，無電離輻射，臨床轉(zhuǎn)化潛力大；（5）空間/時間分辨率、靈敏度較其他光學(xué)模態(tài)好［26］。本文的組織器官離體NIRF成像時，在各類組織中可見腫瘤信號最強(qiáng)，與胰腺、脾臟組織視覺對比明顯，說明背景組織信號不會干擾腫瘤邊界辨識，證實了本文所構(gòu)建的示蹤劑在顯示胰腺癌病灶和引導(dǎo)徹底切除腫瘤組織方面的效能。除胰腺癌外，ICAM-1也可作為卒中和動脈粥樣硬化的NIRF成像靶標(biāo)［27］，其解剖位置較易區(qū)分，理論上不影響對胰腺癌的成像。已知NIRF是應(yīng)用于胰腺癌的雙模態(tài)成像共同選用的光學(xué)模態(tài)［28-31］。由此可知，本文所采用的NIRF的確是最適用于胰腺癌ICAM-1成像的次級模態(tài)。

胰腺癌多模態(tài)成像的可行性已被涉及其他靶標(biāo)或模態(tài)的多項研究所證實［28-31］，其優(yōu)勢在于：可交叉驗證病灶定位；可引導(dǎo)內(nèi)窺鏡成像或穿刺；可在術(shù)中輔助確定腫瘤組織邊界［19］。本文提出的跨模態(tài)成像策略，對同一單抗分子的雙標(biāo)記策略，可從信源層面進(jìn)行模態(tài)間解剖定位配準(zhǔn)；且相對于分別評價具有不同標(biāo)記而靶向基團(tuán)相同的兩種示蹤劑，本文直接評價雙標(biāo)記示蹤劑可減少工作量。

在生物活性方面，800 CW/Df-ICAM-1單抗作一抗時，前述2種細(xì)胞系表現(xiàn)出的熒光信號強(qiáng)度與ICAM-1單抗作一抗時相似，說明本文所采用的熒光團(tuán)和配合體耦聯(lián)修飾方法并未顯著減弱ICAM-1單抗的親和力。在化學(xué)穩(wěn)定性方面，活體PET成像、組織器官離體NIRF成像中均未見骨攝取，說明在前述示蹤劑分子中[89Zr]鋯與Df形成穩(wěn)定配合物，未見體內(nèi)脫標(biāo)；在組織器官離體NIRF成像中，肝攝取不如腫瘤明顯，說明疏水性熒光團(tuán)脫落很少；以上現(xiàn)象都說明本文所構(gòu)建的新型示蹤劑穩(wěn)定性良好。

圖4 胰腺癌模型鼠跨模態(tài)成像的典型圖像Fig.4 Typical intermodal images of mouse models of pancreatic cancer.

圖5 BxPC-3胰腺癌模型鼠組織器官原位離體近紅外熒光成像的典型圖像Fig.5 In situ ex vivo near-infrared fluorescent imaging of typical BxPC-3 mouse model of pancreatic cancer.

本文局限之處在于：（1）采用異種移植瘤模型，故小鼠抗人單抗示蹤劑可能并不能反映小鼠的生理性ICAM-1表達(dá)；（2）示蹤劑在肝、脾都持續(xù)高攝取，可能是由于內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)對抗體的典型非特異性吸附-消除作用；（3）定植于細(xì)胞表面的膜型ICAM-1，其胞外結(jié)構(gòu)域可被蛋白酶水解脫落，形成配體結(jié)合能力相當(dāng)?shù)目扇苄蜕⒉サ窖褐校?,13］，可能消耗部分示蹤劑，干擾對腫瘤的靶向性。為抵償此損失，本文提高了示蹤劑注射劑量。故脾中高攝取可能是因為疏水性800 CW熒光團(tuán)介導(dǎo)上述示蹤劑分子自聚集［28］；（4）本例采用了裸鼠皮下移植瘤模型。而基因工程或病理組織原位移植瘤模型，將能更好地模擬示蹤劑與腫瘤微環(huán)境間的相互作用。

綜上所述，本文報道了以ICAM-1為標(biāo)志物，基于NIRF熒光團(tuán)/[89Zr]鋯核素雙標(biāo)記單抗示蹤劑，對胰腺癌組織進(jìn)行臨床前靶向PET/NIRF 跨模態(tài)成像是可行的。這為同時實現(xiàn)腫瘤活體全身成像和腫瘤組織ICAM-1的原位可視化提供了例證?；贗CAM-1靶向成像進(jìn)行病灶檢測、手術(shù)導(dǎo)航、患者分層和預(yù)后評估，有望幫助實現(xiàn)更好的腫瘤精準(zhǔn)診療實踐。

圖6 胰腺癌移植瘤切片經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后的熒光共聚焦顯微成像Fig.6 Confocal imaging of tissue sections from implanted tumors after immuno-fluorescent staining.Scale bar:100 μm.