五味苦參腸溶膠囊對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠關(guān)于miR-124/STAT3通路表達(dá)影響的研究

張瑞洲 鮑秀琦 韓宇鵬 姜威 陳剛 甘旭穎

【摘要】目的 探究五味苦參腸溶膠囊（Five-Flavor Sophora flavescens Enteric-Coated Capsules FSEC）對(duì)葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis UC）模型小鼠結(jié)腸組織中miR-124/STAT3通路表達(dá)的影響。方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組、FSEC組，每組10只。模型組、FSEC組飲用3%DSS水7d，空白組正常飲水7d。造模完成后，F(xiàn)SEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d，空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。隨后，將全部小鼠切換到正常飲食，觀察各組小鼠的一般狀態(tài)，計(jì)算DAI評(píng)分。一周后處死小鼠，取結(jié)腸組織。提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-124/STAT3通路的表達(dá)水平。結(jié)果：miR-124中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），F(xiàn)SEC組與模型組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。STAT3中模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）、FSEC組與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相對(duì)表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】五味苦參腸溶膠囊;潰瘍性結(jié)腸炎;miR-124/STAT3通路

【中圖分類號(hào)】R97 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ? 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）12--02

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性免疫介導(dǎo)的大腸炎癥，常與直腸炎癥有關(guān)，但通常向近端延伸，累及結(jié)腸的其他區(qū)域[1]。主要癥狀為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便伴腹痛、里急 后重和不同程度的全身癥狀[2]長(zhǎng)期潰瘍性結(jié)腸炎也與明確的不典型增生和結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[1]。傳統(tǒng)的UC口服藥物包括但不僅限于5-氨基水楊酸藥物（5-ASA），糖皮質(zhì)激素，英夫利昔單抗等。但是傳統(tǒng)口服藥物存在療效欠佳，不良反應(yīng)明顯等問(wèn)題。故在UC的臨床治療中，需要尋找一種療效好，不良反應(yīng)輕的口服藥物。五位苦參腸溶膠囊（FSEC）是仝戰(zhàn)旗【3-5】主任研制的國(guó)家新藥，現(xiàn)有的研究表明，傳統(tǒng)的中醫(yī)方法【6】治療UC的效果不亞于UC的常規(guī)臨床治療，且不良反應(yīng)相較糖皮質(zhì)激素等藥物小。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢驗(yàn)FSEC對(duì)DSS誘導(dǎo)UC小鼠模型中miR-124/STAT3通路的影響，驗(yàn)證FSEC的療效，為FSEC應(yīng)用到臨床治療UC提供科學(xué)依據(jù)。

1材料及方法

1.1藥物、試劑與儀器：葡聚糖硫酸鈉（DSS）（美國(guó)MP公司），Hotstart HiTaq兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑、miRNA 第一鏈 cDNA 合成、miRNA熒光定量PCR試劑盒、TRIzol（生工生物上海），Gel-Green染料（碧云天），DNAmaker（莊盟），6*loading Buffer（takara）熒光定量PCR管（賽默飛）光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯），PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雄性C57BL/6小鼠（30只，體重25-27克）購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司

1.3實(shí)驗(yàn)方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組、FSEC組，每組10只。各組小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組、FSEC組飲用濃度為3%DSS飲用水7d，空白組正常飲水7d。造模完成后，F(xiàn)SEC組給予3.84/kg/天濃度的五味苦參腸溶膠囊溶液灌腸7d，空白組及模型組則給與等量的生理鹽水灌腸7d。

1.4小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI評(píng)分）：通多對(duì)小鼠有無(wú)黏液樣便、肉眼血便、重量減輕、活動(dòng)度減少、毛色變差等情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index DAI）評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1【7】，

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)（RT-PCR）：

①（1）取各組小鼠的結(jié)腸組織50mg，將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿等RNA提取步驟獲得總RNA ，

（2）使用miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒進(jìn)行合成cDNA

（3）根據(jù)試劑說(shuō)明進(jìn)行熒光定量的反應(yīng)體系配置

（4）設(shè)定反應(yīng)程序

引物序列：miR-124上游 5′- GGACTTTCTTCA TTCACACCG-3′。

miR-124下游5′- GACCACTGAGGTTAGAGCCA-3′。

用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量

②取各組小鼠的結(jié)腸組織50mg，將取好的組織在液氮中用加入了1ml TRIzol的勻漿器中勻漿，后續(xù)通過(guò)Hotstart HiTaq兩步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得最終cDNA，并根據(jù)試劑說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系配比。引物序列如下：

STAT3 ?上游 5′-GAAGGACA TCAGCGGTAAGA-3′。

STAT3 ?下游5′-AGA TAGACCAGTGGAGACAC-3′。

反應(yīng)條件95℃，10min 用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0和Graphpad Prism8據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠的一般情況變化及臨床表現(xiàn)

空白組：小鼠一般情況良好，體重隨時(shí)間逐漸增加，無(wú)明顯稀便、黏液樣便、肉眼血便等，活動(dòng)自如，毛色亮澤。

模型組：小鼠一般情況差，飲食減少，可見(jiàn)黏液便及肉眼血便，體重明顯減輕，活動(dòng)度差，精神不佳，毛色變差，無(wú)光澤。

FSEC組：模型小鼠給予FSEC灌腸治療后，較于模型組有顯著改善，體重減輕受到控制，活動(dòng)度有所恢復(fù)，雖可見(jiàn)稀便及偶有黏液便，但無(wú)肉眼血便。

2.2各組小鼠結(jié)腸組織中miR-124及STAT3的相對(duì)表達(dá)量

根據(jù)miR-124的相對(duì)表達(dá)量可見(jiàn)，模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），F(xiàn)SEC組與模型組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。STAT3的相對(duì)表達(dá)量，模型組及FSEC組均與空白組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）、FSEC組與模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相對(duì)表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)。

空白組（n=3） 模型組（n=3） FSEC組（n=3）

miR-124 1.00±0.08 0.68±0.15 0.81±0.16

STAT3 1.00±0.11 5.22±1.25 3.83±0.95

* P<0.05，**P<0.01

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性炎癥性腸道疾?。↖BD）。這些疾病在嚴(yán)重程度、頻率以及腸粘膜、先天和獲得性免疫系統(tǒng)以及微生物群之間的相互作用都很復(fù)雜，到目前為止還沒(méi)有確定疾病的病因。雖然治療UC的藥物有很多，包括氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑，這些藥物通常對(duì)大多數(shù)患者有效，但不是所有患者都有效。而且，由于療程較長(zhǎng)，它們的使用通常受到不良反應(yīng)的限制，停用它們往往會(huì)導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，就需要新的、更有效的療法。

MicroRNA是一種小的非編碼RNA寡核苷酸，它在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)信使RNA（Mrna）降解和/或抑制與30個(gè)非翻譯區(qū)結(jié)合的靶基因的翻譯，可以調(diào)節(jié)大量基因的表達(dá)，并參與不同的人類疾病。其中MIR-124可以抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，許多炎癥性疾病及腫瘤疾病的研究中都能看到miR-124/STAT3通路的影子：比如在食道癌中MiR-124過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)STAT3的mRNA和蛋白水平抑制疾病發(fā)展、STAT3信號(hào)通路參與了miR-124介導(dǎo)的對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抑瘤作用。而對(duì)于UC而言，以往的研究表明IL6-STAT3信號(hào)通路在UC中的重要性，STAT3 缺乏顯著降低了干擾素 （IFN）-γ、IL-6 和 IL-17A 的產(chǎn)生，而 IL-10 分泌增加，表明 STAT3 可能成為潰瘍性結(jié)腸炎的治療靶點(diǎn)，以往的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-124對(duì)STAT3磷酸化的抑制作用最大，可以直接調(diào)節(jié)人類結(jié)腸細(xì)胞中STAT3的表達(dá)且UC活動(dòng)期兒童患者miR-124表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致STAT3表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)下游靶基因VEGF、BCL2、BCLXL和MMP9表達(dá)上調(diào)。UC活動(dòng)期患兒組織中miR-124的抑制歸因于STAT3啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。因此，靶向miR-124和STAT3可能為UC的治療提供了一種新的途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與模型組相比FSEC治療組可使miR-124表達(dá)水平上升，STAT3表達(dá)水平下降，證明FSEC可以通過(guò)影響miR-124/STAT3通路來(lái)達(dá)到治療效果，證明FSEC對(duì)UC有一定治療效果。

參考文獻(xiàn)：

【1】Rubin， D.T.， Ananthakrishnan， A.N.， Siegel， C.A.， Sauer， B.G.， & Long， M.D. （2019）. ACG Clinical Guideline： Ulcerative Colitis in Adults. The American Journal of Gastroenterology， 114， 384-413.

【2】吳開(kāi)春，梁潔，冉志華，錢家鳴，楊紅，陳旻湖，何瑤.炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018年·北京）[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，2018，38（09）：796-813.

【3】羅丹，高路，仝戰(zhàn)旗，張晨.五味苦參腸溶膠囊對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶1、白細(xì)胞介素-1β蛋白的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2018，39（02）：140-143+149.

【4】羅丹，高路，仝戰(zhàn)旗，王世達(dá)，張亮，張晨.五味苦參腸溶膠囊對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎性因子的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（10）：4719-4722.

【5】羅丹. 基于NLRP3/IL-1β/IL-17信號(hào)通路探討五味苦參腸溶膠囊治療潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究[D].中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院，2018.

【6】李軍祥，陳誩.潰瘍性結(jié)腸炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見(jiàn)（2017年）[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2018，26（02）：105-111+120.

【7】朱成雷，穆晶晶，徐靜雯，王琳琳，周鄭坤，鄭元林，陳才法.紫甘薯花青素對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道屏障損傷的修復(fù)作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2020，36（10）：1844-1853.

通訊作者：鮑秀琦（1963-），女，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，

第一作者：張瑞洲（1995-），男，碩士生在讀

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題（2019-KYYWF-1346）