茶籽餅生物脫毒工藝的優(yōu)化

管維 詹逸舒 李明紅 蘭時(shí)樂 管桂萍 文金

摘要 以茶籽餅中茶皂素降解率為主要指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)嗜酸小球菌固體發(fā)酵茶籽餅的生物脫毒工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌適宜的生物脫毒工藝條件為茶籽餅粕85%、麥麩15%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、NaCl 3%、含水量70%、種齡24 h、發(fā)酵時(shí)間5 d、接種量20%、初始pH 6.0、發(fā)酵溫度32 ℃，在此優(yōu)化工藝條件下茶籽餅中茶皂素的降解率可達(dá)到68.42%，比優(yōu)化前提高了57.13%。

關(guān)鍵詞 嗜酸小球菌;茶籽餅粕;茶皂素;固態(tài)發(fā)酵

中圖分類號(hào) S816? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）04-0175-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.048

Optimization of Tea Seed Cakes Biological Detoxification Process

GUAN Wei1， ZHAN Yi-shu2， LI Ming-hong3 et al

（1. Market Supervision and Administration Bureau in Nanyue District of Hengyang City， Hengyang， Hunan 421900; 2.Livestock and Fisheries Affairs Center in Changning City，Changning， Hunan 421500; 3.? Administration Bureau of Nanyue Hengshan National Nature Reserve， Hengyang， Hunan 421900）

Abstract Taking the degradation rate of tea saponin as the main index， the single-factor test and orthogonal test were used to optimize the biodetoxification process conditions of tea seed cake by solid fermentation of Pediococcus acidilactici. The results showed that the suitable detoxification process conditions of tea seed cake were as follows： 85% tea seed cake， 15% wheat bran， 3% glucose， 0.1% KH2PO4， 0.15% MgSO4·7H2O， 3% NaCl， 70% water content， seed age 24 h， inoculation amount 20%， initial pH 6.0， fermentation temperature 32 ℃.Under these conditions， the degradation rate of tea saponin in tea seed cake reached 68.42%， which was 57.13% higher than before optimization.

Key words Pediococcus acidilactici;Tea seed cake;Tea saponin;Solid state fermentation

作者簡介 管維（1986—），女，湖南衡陽人，工程師，碩士，從事質(zhì)量檢驗(yàn)工作。

收稿日期 2020-06-15

茶籽餅，又稱為茶粕、茶枯，是油茶果實(shí)榨油后剩下的渣滓[1]。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2010年我國油茶種植面積達(dá)到200余萬hm2，年產(chǎn)油茶籽109萬t，油茶籽粕70多萬t[2]。但是，由于茶籽餅粕中含有茶皂素等毒性物質(zhì)以及單寧、粗纖維等抗?fàn)I養(yǎng)成分，限制了其在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用范圍。目前主要采用物理法、化學(xué)法、微生物發(fā)酵法[3-9]以及綜合法對(duì)茶籽餅粕進(jìn)行脫毒處理，常用的方法有化學(xué)法與微生物發(fā)酵法[10]。其中，茶籽餅粕微生物發(fā)酵脫毒國內(nèi)外進(jìn)行了研究。丁麗霞[3]以油茶粕為研究對(duì)象，以茶皂素含量為指標(biāo)，利用黑曲霉對(duì)油茶粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵降解茶皂素，在最優(yōu)工藝條件下降解率達(dá)到89.99%。練杰等[11]利用黑曲霉、枯草芽孢桿菌的混合菌對(duì)茶籽餅粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，在最優(yōu)工藝條件下可使茶籽粕的茶皂素降解率約為93.28%。黃浦[12]利用混菌液態(tài)發(fā)酵降解茶皂素，在最佳條件下進(jìn)行混菌液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明混菌降解茶皂素的降解率為（73.76±0.63）%。王小姣等[13] 對(duì)飼用嗜酸小球菌液體生料發(fā)酵工藝研究，結(jié)果表明液體生料發(fā)酵技術(shù)適合于飼用嗜酸小球菌的生產(chǎn)。

筆者以茶皂素降解率為考察指標(biāo)，對(duì)茶籽餅進(jìn)行微生物固體發(fā)酵脫毒工藝進(jìn)行了研究，首先通過單因素試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成（茶籽餅與麥麩的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量）及發(fā)酵條件（含水量、發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH、種齡），然后選取對(duì)發(fā)酵影響顯著的因素進(jìn)行正交優(yōu)化。該研究優(yōu)化了茶籽餅生物脫毒工藝條件，為微生物發(fā)酵茶粕飼料提供了發(fā)酵工藝條件，為使茶籽餅成為一種優(yōu)良的蛋白飼料資源打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。

試驗(yàn)菌種為嗜酸小球菌（Pediococcus acidilactici），聯(lián)合湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)衡陽市荊田灣農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供的自然堆放的茶籽餅粕原料進(jìn)行篩選所得的菌種。

1.1.2 主要試劑。

茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品（98.2%茶皂素）購自陜西帕尼爾生物科技有限公司;茶籽餅、麥麩（市場購得，無霉變與蟲蛀）、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸二銨、無水乙酸鈉、吐溫-80、香草醛、甲醇（AR級(jí)）、濃 H2SO4、牛肉膏、蛋白胨（BR級(jí)，上海盛思生化科技有限公司）;酵母膏（BR級(jí)，上海天鵝啤酒有限公司）;瓊脂、酵母抽提粉。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備。

紫外可見分光光度計(jì)（752型，上海光譜儀器有限公司）;恒溫水箱（SHHW21.420AII，天津市泰斯特儀器有限公司）;臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ4，湖南赫西儀器裝備有限公司）;高速多功能粉碎機(jī)（TYSP-400A，浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司）;超聲波清洗機(jī)（JCX-250W，山東濟(jì)寧超聲電子儀器廠）;電子天平（KF型，浙江凱豐集團(tuán)有限公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基。

1.1.4.1

MRS培養(yǎng)基（培養(yǎng)嗜酸小球菌）。蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、吐溫80 0.1 mL、K2HPO4 0.2%、醋酸鈉0.5%、檸檬酸二銨0.2%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4· 4H2O 0.025%、蒸餾水100 mL，pH 6.2～6.6，115 ℃下滅菌25 min。

1.1.4.2

基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基。茶皂素15.0 g、葡萄糖5 g、蛋白胨5 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、酵母抽提粉3 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.5，121 ℃下滅菌25 min。

1.1.4.3

基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基。茶籽餅粕90%、麥麩10%、葡萄糖4%、KH2PO4 0.15%、MgSO4·7H2O 0.1% 、NaCl 3%，pH 7.5，固水比1∶0.5。

1.2 方法

1.2.1 種子液初步培養(yǎng)及固體發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.1.1

種子液初步培養(yǎng)。將斜面菌種接種于種子液培養(yǎng)基中，于30 ℃﹑160 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，備用;嗜酸小球菌接種于MRS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.1.2

種子液固體發(fā)酵培養(yǎng)。在250 mL三角瓶中裝入50 g 固體發(fā)酵培養(yǎng)基（以干基計(jì)），采用接種量為10%（V/w），將培養(yǎng)好的種子液接入基礎(chǔ)固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.2.2

固體發(fā)酵樣品茶皂素降解率的測定。采用香草醛-濃硫酸法[14-15]測定固體發(fā)酵樣品茶皂素的降解率。按照以下公式計(jì)算茶皂素降解率：茶皂素降解率=（發(fā)酵后茶皂素濃度/發(fā)酵前茶皂素濃度）×100%。

1.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基其他組成不變，采用單因素試驗(yàn)法，依次改變培基的茶籽餅與麥麩的添加比例（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25）、葡萄糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、KH2PO4添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、MgSO4·7H2O添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），等量接種種子液培養(yǎng)液于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固體發(fā)酵。測定發(fā)酵前后茶籽餅中茶皂素濃度，以茶皂素降解率為指標(biāo)，優(yōu)化篩選不同茶籽餅與麥麩的比例、葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、MgSO4·7H2O添加量等對(duì)菌種降解茶皂素的影響。每個(gè)處理3個(gè)平行。

1.2.4 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化。通過改變影響發(fā)酵的條件，測定發(fā)酵前后茶籽餅中茶皂素的濃度，以茶皂素降解率為考察指標(biāo)，在“1.2.3”優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，考察含水量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH、接種量以及種齡對(duì)茶皂素降解率的影響，研究最佳固體發(fā)酵條件。每個(gè)處理3個(gè)平行。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法[10]設(shè)計(jì)用含水量、初始pH、接種量、種齡等對(duì)嗜酸小球菌降解茶皂素影響較大的因素進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用WPS Office 軟件進(jìn)行誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶籽餅茶皂素含量的測定

利用香草醛-濃硫酸方法繪制茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到線性回歸方程y=0.610 7x+0.010 5，R2=0.992 8，表明茶皂素濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。采用香草醛-濃硫酸方法測得茶籽餅1 g中含茶皂素0.174 5 g，即茶皂素含量為17.45%。

2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 茶籽餅與麥麩的添加比例。

改變培養(yǎng)基中茶籽餅與麥麩的添加比例（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20、75∶25）在其他條件不變的情況下，32 ℃恒溫發(fā)酵5 d，80 ℃烘干后測定培養(yǎng)基中的茶皂素含量并計(jì)算茶皂素的降解率，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)茶籽餅與麥麩的添加比例為85∶15時(shí)，茶皂素降解率最高（11.29%）。在一定范圍內(nèi)，茶皂素降解率隨茶籽餅比例的增加而增大，說明茶皂素的增加在一定范圍內(nèi)能夠加強(qiáng)菌體的生長繁殖能力，但當(dāng)茶籽餅所占比例過大時(shí)，培養(yǎng)基中的茶皂素濃度高，對(duì)菌體的生長代謝起抑制作用，從而影響對(duì)茶皂素的降解率。因此，選擇茶籽餅與麥麩的添加比例為85∶15，用于后續(xù)研究。

2.2.2 葡萄糖添加量。

在其他條件不變的情況下，改變培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量，32 ℃恒溫發(fā)酵5 d，80 ℃烘干后，測定培養(yǎng)基中的茶皂素含量并計(jì)算茶皂素的降解率，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)葡萄糖添加量為2%～3%時(shí)，茶皂素降解率隨葡萄糖添加量的增加而增加;當(dāng)葡萄糖添加量為3%時(shí)，茶皂素降解率達(dá)到33.07%，但當(dāng)葡萄糖添加量大于3%時(shí)，茶皂素降解率顯著且持續(xù)下降。究其原因，可能是由于培養(yǎng)基中碳含量過高或過低，從而使培養(yǎng)基中的碳氮比例失調(diào)，導(dǎo)致菌體生長代謝能力下降。因此，選擇3%作為葡萄糖的最佳添加量。

2.2.3 KH2PO4添加量。

在其他條件不變的情況下，改變培養(yǎng)基中KH2PO4添加量，32 ℃恒溫發(fā)酵5 d，80 ℃烘干后測定培養(yǎng)基中的茶皂素含量并計(jì)算茶皂素的降解率，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，茶皂素降解率隨KH2PO4添加量的增加而增加，當(dāng)KH2PO4添加量為0.1%時(shí)茶皂素降解率達(dá)到41.38%，但當(dāng)KH2PO4添加量超過0.1%茶皂素降解率隨著KH2PO4添加量的增加而下降。磷是微生物細(xì)胞中核蛋白、核酸、ATP、磷脂、輔酶等的重要原料，能保持細(xì)胞內(nèi)ATP代謝的平衡，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的酸堿平衡，參與體內(nèi)能量的代謝。若培養(yǎng)基中磷含量不足，會(huì)影響微生物的代謝生長速度，但若磷含量超過微生物生長代謝的需要量，則會(huì)對(duì)微生物的生長起抑制作用。因此，選擇0.1%作為KH2PO4的最佳添加量。

2.2.4 MgSO4·7H2O添加量。

改變培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%），其他條件保持不變，32 ℃恒溫發(fā)酵5 d，80 ℃烘干后測定培養(yǎng)基中的茶皂素含量并計(jì)算茶皂素的降解率，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，在一定范圍內(nèi)，茶皂素降解率隨MgSO4·7H2O添加量的增加而增加，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.15%時(shí)茶皂素降解率最高（48.83%）。鎂參與能量代謝、蛋白質(zhì)和核酸的合成及催化酶的激活和抑制等。若培養(yǎng)基中鎂含量過低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜和核糖體的穩(wěn)定性降低，對(duì)微生物營養(yǎng)的吸收與蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生影響，從而影響機(jī)體的正常生長代謝;若鎂含量過高，則會(huì)對(duì)微生物生長代謝起抑制作用。因此，選擇0.15%作為MgSO4·7H2O的最佳添加量。

2.3 固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 含水量。在上述篩選出的培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，改變培養(yǎng)基的含水量，培養(yǎng)后測定茶皂素含量并計(jì)算茶皂素降解率，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，當(dāng)含水量為40%～70%時(shí)，茶皂素降解率隨著含水量的增加而增加。當(dāng)含水量為70%時(shí)茶皂素降解率最大，達(dá)到60.97%;當(dāng)含水量超過70%時(shí)，茶皂素降解率顯著降低。茶籽餅遇水易凝結(jié)，含水量過高的培養(yǎng)基易結(jié)塊，菌體生長會(huì)受到抑制;當(dāng)含水量過低時(shí)，培養(yǎng)基比較松散，不能給菌體提供適宜的生長環(huán)境。固體培養(yǎng)基的含水量是構(gòu)成微生物生長代謝環(huán)境的重要因素，因此選擇70%作為培養(yǎng)基的最佳含水量。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間。

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶皂素降解率的影響如圖7所示。從圖7可以看出，發(fā)酵初期隨著時(shí)間的增加，茶皂素降解率逐漸增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)茶皂素降解率基本不發(fā)生變化，即培養(yǎng)基經(jīng)過5 d發(fā)酵后，茶皂素降解率趨于穩(wěn)定。因此，選擇5 d作為后續(xù)研究的發(fā)酵時(shí)間。

2.3.3 接種量。

不同接種量對(duì)茶皂素降解率的影響如圖8所示。由圖8可知，不同接種量對(duì)茶皂素降解率影響顯著。當(dāng)接種量為15%時(shí)，茶皂素降解率最大，達(dá)到66.19%;當(dāng)接種量小于15%時(shí)，茶皂素降解率隨接種量的增加而增加;當(dāng)接種量大于15%時(shí)，茶皂素降解率隨接種量的增加而降低。若接種量過大，發(fā)酵前期菌體總數(shù)大，菌體大量生長使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，且液體種子液的副產(chǎn)物過多，導(dǎo)致發(fā)酵延滯期延長，從而引起相同的發(fā)酵周期茶皂素降解率降低。因此，選擇15%作為最佳接種量，用于后續(xù)研究。

2.3.4 初始pH。

不同初始pH對(duì)茶皂素降解率的影響如圖9所示。從圖9可以看出，初始pH對(duì)菌體生長代謝的影響顯著，在一定范圍內(nèi)隨著培養(yǎng)基初始pH的升高，茶皂素降解率隨之增加。當(dāng)初始pH為6.5時(shí)，茶皂素降解率最大，達(dá)到67.85%。不同的微生物都有適合生長的pH范圍及最適生長pH，嗜酸小球菌的生長pH偏酸性范圍，試驗(yàn)表明當(dāng)初始pH處于酸性范圍內(nèi)時(shí)，培養(yǎng)基中的茶皂素降解率大于初始pH處于堿性范圍內(nèi);若初始pH過高或過低則會(huì)影響菌體內(nèi)酶的活性和穩(wěn)定性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度及微生物對(duì)營養(yǎng)的吸收。因此，選擇6.5作為培養(yǎng)基的最佳初始pH。

2.3.5 種齡。

不同種齡對(duì)茶皂素降解率的影響如圖10所示。從圖10可以看出，當(dāng)種齡為24 h時(shí)，茶皂素降解率最大，達(dá)到68.65%。當(dāng)種齡較低時(shí)，菌體處于延滯期，導(dǎo)致細(xì)胞增長速率過慢，從而延長了延滯期;當(dāng)種齡偏高時(shí)，菌體老化，菌種活力減弱，代謝產(chǎn)物增多，從而延長了發(fā)酵周期。因此，選擇24 h作為最佳種齡。

2.3.6 正交試驗(yàn)。

采用正交試驗(yàn)法，選擇對(duì)茶皂素降解率影響較大的因素（含水量、初始pH、接種量、種齡）進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，根據(jù)極差R大小可知，各因素對(duì)茶皂素降解率的影響從大到小依次為含水量、初始pH、種齡、接種量。試驗(yàn)條件下最優(yōu)組合為A3B1C3D2。發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為茶籽餅85%、麥麩15%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、含水量70%，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 6.0、接種量為20%、種齡為24 h、發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃。在此工藝條件下，茶皂素降解率達(dá)到68.42%，比優(yōu)化前提高了57.13%。

3 結(jié)論與討論

微生物發(fā)酵法是茶籽餅粕降解的主要方法，被認(rèn)為是目前發(fā)展?jié)摿ψ畲蟮牟枳扬炂擅摱咎幚矸椒?。其原理是在茶籽餅粕中添加微生物進(jìn)行發(fā)酵，使添加的微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基上大量生長并同時(shí)將茶皂素分解利用，從而降低茶皂素的含量，達(dá)到去毒的目的。微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生包括酶、促生長因子以及抗菌物質(zhì)等有益的代謝產(chǎn)物，同時(shí)降低了茶籽餅粕中的單寧和纖維素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，加上使用的發(fā)酵微生物菌種本身是動(dòng)物益生菌，能起到改善動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡的作用。

該試驗(yàn)以茶籽餅為原料，對(duì)茶籽餅生物脫毒及其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了茶籽餅粕添加量、碳源、氮源、無機(jī)鹽種類及添加量、含水量、初始pH、種齡、接種量、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)茶皂素降解率的影響，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件，最終得到最佳脫毒工藝條件。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，在茶籽餅脫毒過程中含水量與初始pH是影響茶皂素降解率的關(guān)鍵因素，茶籽餅與麥麩的添加比例85∶15、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.15%、含水量70%，最佳培養(yǎng)條件為初始pH 6.0、接種量20%、種齡24 h、發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度32 ℃。在此條件下茶皂素降解率為68.42%。在此工藝條件下，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配制完成后無需滅菌，這在一定程度上降低了能耗，且操作簡單，對(duì)設(shè)備要求低，降低了生產(chǎn)成本，為茶籽餅生物脫毒技術(shù)的推廣提供了技術(shù)支持。

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