伊犁河谷地區(qū)牛病毒性腹瀉病毒基因型鑒定與分析

摘要 為摸清伊犁河谷地區(qū)牛場(chǎng)牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）感染的病毒基因型，利用BVDV基因組5′端非翻譯區(qū)（5′-UTR）通用型引物，采用一步法 RT-PCR對(duì)疑似感染樣品進(jìn)行基因擴(kuò)增、序列測(cè)定與比對(duì)分析以及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果顯示：12份疑似樣品中，有1份樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性，基因型鑒定為BVDV2型。該研究表明伊犁河谷規(guī)?；?chǎng)內(nèi)存在BVDV2型感染，為該地區(qū)規(guī)?；?chǎng)病毒性腹瀉病的防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 伊犁河谷;BVDV;基因型;鑒定

中圖分類號(hào) S852.65+3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）04-0082-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.021

Genotype Identification and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus in Yili Valley Area

WANG Chuan-feng

（Yili Vocational and Technical College， Yining， Xinjiang 835000）

Abstract In order to find out the genotype of BVDV infection in cattle farms in Yili Valley area，using a universal primer for the 5′-UTR of the BVDV genome，gene amplification，sequencing and blasting，phylogenetic tree construction were conducted on suspected infection samples by one-step RT-PCR. The results showed that 1 of 12 suspected samples was PCR positive， and the genotype was identified as BVDV2. The results of the study indicated that there was BVDV2 infection in large-scale cattle farms in the Yili Valley，which provided theoretical basis for the prevention and control of BVD in large-scale cattle farms in this area.

Key words Yili Valley;BVDV;Genotype;Identification

基金項(xiàng)目 新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃項(xiàng)目（XJEDU2016S094）。

作者簡(jiǎn)介 王傳鋒（1982—），男，安徽淮南人，副教授，碩士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期 2020-06-30

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬，主要引起牛病毒性腹瀉[1]。依據(jù)BVDV保守端基因5′-UTR序列的差異性，可將病毒分為2種基因型，即BVDV1和BVDV2。其中，國(guó)內(nèi)外已對(duì)BVDV1進(jìn)行了廣泛研究，許多經(jīng)典菌株和常見(jiàn)的疫苗菌株都屬于該基因型。BVDV1型感染牛常常表現(xiàn)出發(fā)熱、腹瀉和黏膜潰爛等癥狀;BVDV2型感染牛通常發(fā)病較急，臨床表現(xiàn)主要為高熱、下痢、血小板減少癥、黏膜出血、呼吸困難并伴有流產(chǎn)和高死亡率[2]。感染BVDV的患畜，病毒存在于血清、凍精和胚胎中，以此為原料生產(chǎn)的生物制品將會(huì)給牛場(chǎng)和生物制品制造企業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Olafson 等[3]首次在感染牛腸道及排泄物中發(fā)現(xiàn)BVDV。目前，該疾病在世界范圍內(nèi)流行，尤其是在發(fā)達(dá)國(guó)家規(guī)?；?chǎng)中。近年來(lái)，新疆牛病毒性腹瀉病的流行形式也發(fā)生了一定的變化，由原來(lái)較多見(jiàn)的隱性感染和散發(fā)性病例演變?yōu)楝F(xiàn)今的地方性流行和暴發(fā)，加上BVDV基因型的多樣性、免疫耐受性以及在患畜體內(nèi)產(chǎn)生的持續(xù)性感染給防控該病帶來(lái)了一定的困難。筆者采用一步法RT-PCR技術(shù)從采集的疑似病料（肛拭子）中擴(kuò)增目的片段，并進(jìn)行 BVDV基因分型鑒定，以期掌握伊犁河谷地區(qū)規(guī)?；?chǎng) BVDV 流行株的基因型，分析此基因型與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)BVDV病毒株之間的關(guān)系，為防控該病提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

伊犁河谷地區(qū)部分規(guī)模化牛場(chǎng)，采集疑似犢牛腹瀉樣品（肛拭子）共12份，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

1.2.1 主要試劑。

RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司;高純質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自百泰克生物技術(shù)（北京）有限公司;PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit生物制劑購(gòu)自TaKaRa 生物工程有限公司。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備。PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)T100，美國(guó)Bio-Rad公司）;全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)K8300，南京世研儀器設(shè)備有限公司）;凝膠電泳儀（型號(hào)DYCP-44N，北京六一生物科技有限公司）;電泳儀電源（DYY-5D型，北京六一生物科技有限公司）;低溫高速離心機(jī)（型號(hào)5418R，德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 引物

根據(jù)已知牛病毒性腹瀉病毒5′-UTR特異性通用型引物擴(kuò)增目的基因，預(yù)估擴(kuò)增片段大小為267 bp，引物由北京鼎國(guó)生物科技有限公司合成。上游引物（5′-UTR-F）為5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′，

下游引物（5′-UTR-R）為5′-GGAACTCCATGTGCCATGTACA-3′。

1.4 BVDV參考毒株

試驗(yàn)所用參考株序列均來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，具體如表1所示。

1.5 總RNA提取

參照RNA提取試劑盒使用說(shuō)明書中的方法對(duì)12份檢測(cè)樣品進(jìn)行總RNA提取。

1.6 一步法RT-PCR擴(kuò)增

以疑似樣品中提取的總RNA為模板，根據(jù)PrimeScriptTM OneStep RT-PCR Kit 試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。具體反應(yīng)體系如下：總RNA模板10 μL，5′-UTR-F 1 μL，5′-UTR-R 1 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，2×1 Step Buffer 25 μL，RNase Free ddH2O 11 μL，總體積為50 μL。具體RT-PCR 反應(yīng)條件如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 5 min，95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。最后，將RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并觀察電泳結(jié)果。

1.7 目的基因的克隆與序列測(cè)定

收集凝膠電泳目的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行純化，將純化后的目的基因與pMD18-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至Escherichia? coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行培養(yǎng)，挑取白色菌落開(kāi)展PCR鑒定。用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定后將陽(yáng)性重組質(zhì)粒DNA送交北京鼎國(guó)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示12份疑似樣品中有1份樣品擴(kuò)增出約267 bp的條帶，與預(yù)期的目的基因大小相符（圖1）。

2.2 核苷酸序列同源性比較

將獲得的目的基因測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考毒株進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示測(cè)序基因序列屬于BVDV，命名為BVDV-YL1。將BVDV-YL1與19個(gè)參考株進(jìn)行核苷酸同源性比較（圖2），結(jié)果顯示BVDV-YL1與中國(guó)新疆XJ04株和BVDV2-125C株核苷酸同源性分別為96.4%和96.0%，與 BVDV1參考株核苷酸同源性為37.6%～77.9%。測(cè)序結(jié)果表明，BVDV-YL1屬于BVDV2型毒株。

2.3 BVDV-YL1 基因遺傳進(jìn)化樹分析

根據(jù)BVDV的5′-UTR 基因核苷酸序列同源性分析，構(gòu)建BVDV-YL1遺傳進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，BVDV-YL1毒株與中國(guó)新疆XJ04株和BVDV2-125C株親緣性較近，同屬BVDV2型。

3 討論

BVDV1型和BVDV2型的同源性約60%。其中，BVDV1可分為18個(gè)基因亞型（BVDV1a～BVDV1r）[4]，BVDV2 可分為BVDV2a、BVDV2b、BVDV2c和BVDV2d四種亞型[5]?；赗NA病毒具有較高的基因突變性，BVDV基因的更多新亞型將被發(fā)現(xiàn)。結(jié)果顯示，病毒的亞型與流行區(qū)域密切相關(guān)。比如，BVDV在歐洲主要以BVDV1a、BVDV1b、BVDV1d、BVDV1e、BVDV1f等多種亞型和BVDV2型為主[6]，在北美國(guó)家主要以BVDV1b和BVDV2a型為主，日本主要以BVDV1a型的形式存在[7]。在國(guó)內(nèi)，1980年李佑民等[8]首次從流產(chǎn)的胎兒脾臟中分離到BVDV，經(jīng)鑒定為1b亞型。目前，我國(guó)主要存在BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c和BVDV2型。1991年劉崇向等[9]首次在羔羊腹瀉病料中檢測(cè)到BVDV。王青青等[10]在新疆南疆地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)內(nèi)檢測(cè)到BVDV1c的感染。蔡元慶等[11]在新疆石河子和伊犁地區(qū)對(duì)疑似患畜新鮮糞便檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在BVDV1感染。王龍等[12]采用RT-PCR方法從新疆16個(gè)不同地區(qū)的21份樣品中檢測(cè)到17株為BVDV1型，4株為BVDV2型。李娜等[13]在新疆石河子地區(qū)64份牛全血樣品進(jìn)行BVDV檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)全部樣品均為BVDV-1b感染。目前，相關(guān)研究人員已在新疆牛場(chǎng)中檢測(cè)到BVDV1b 、BVDV2、BVDV1c、BVDV1q、BVDV1f和BVDV1型未知亞型，從而證實(shí)了BVDV在新疆范圍內(nèi)流行的多樣性和復(fù)雜性。

新疆是我國(guó)重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地之一，規(guī)?；?chǎng)分別較廣，BVDV的防控形勢(shì)也日趨嚴(yán)重。該試驗(yàn)從伊犁河谷地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)采集的12份疑似樣品中檢測(cè)出1份 BVDV 陽(yáng)性樣品。基因分型鑒定結(jié)果表明，BVDV-YL1 株與中國(guó)新疆XJ04株和BVDV2-125C株親緣性較近，同屬BVDV2型，從而證實(shí)伊犁河谷地區(qū)規(guī)?；?chǎng)中存在 BVDV2型的感染，為該地區(qū)牛病毒性腹瀉病的防控提供了重要的理論支撐。

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