用于小動物活體的熒光-光熱雙模成像系統(tǒng)

陳宏達，張 婳，王振新

（1.中國科學院長春應用化學研究所電分析化學國家重點實驗室,長春130022；2.中國科學技術大學應用化學與工程學院,合肥230026）

隨著小動物成像技術的發(fā)展，活體成像技術的種類及應用范圍日益擴大，并涌現(xiàn)出多種用于小動物成像的專業(yè)設備，為現(xiàn)代生物醫(yī)學基礎研究以及臨床診斷研究提供了有力工具［1，2］.小動物活體成像技術是指應用影像學方法對活體狀態(tài)下的生化過程進行研究的技術，主要包括光學成像（Optical imaging）、核磁共振成像（MRI）、電子計算機斷層掃描（CT）、正電子發(fā)射計算機斷層成像（PET）和超聲成像（US）等［3～7］.其中，光學成像技術因具有非電離、非接觸、靈敏度高、高通量和成本低等優(yōu)點，被廣泛應用于疾病診斷、藥物設計、輔助治療及預后監(jiān)測等領域［8～12］.利用靈敏的光學檢測系統(tǒng)［如電荷耦合器件（CCD）、光電倍增管（PMT）等］，活體光學成像可在活體組織、細胞及分子水平上使體內復雜的生化過程實現(xiàn)可視化，從而對其生物學行為進行定性和定量研究［6］.小動物活體光學成像技術主要包括生物發(fā)光成像和熒光成像2種技術，其中熒光成像是采用熒光材料/物質（如熒光蛋白、有機熒光染料、熒光上轉換納米粒子及量子點等）標記細胞內或體液中特定的分子后再進行成像［7］，因熒光信號遠強于生物發(fā)光，且具有操作簡單、靈敏度高、實時直觀、成像快速、成本低和可同時觀測多分子事件的優(yōu)勢，逐漸成為一種研究腫瘤組織/細胞中特定分子表達/活性水平變化規(guī)律的理想方法，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移監(jiān)測中展現(xiàn)出重要作用［13～15］.目前，國內外已有多家企業(yè)和研究機構研制出了熒光成像系統(tǒng)，這些系統(tǒng)均只具備單一的熒光成像功能，功能相對簡單，無法監(jiān)測到活體治療整個過程.

與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，摻雜稀土元素的上轉換納米粒子（UCNP）能吸收低能量的近紅外光（NIR）并將其轉化為高能量的發(fā)射光（上轉換發(fā)光，UCL），具有大的反斯托克斯位移，可有效降低背景熒光干擾，有利于提高信噪比，同時UCNP具有窄的發(fā)射光帶寬，適合多路成像，無光漂白，可進行長時間重復成像［16～20］.通過合適的物理/化學反應對UCNP進行功能化，可實現(xiàn)UCNP的UCL成像與其它成像模式（MRI，CT，PET等）或治療手段（光熱治療、光動力治療等）的結合，進一步應用于腫瘤的靶向多模態(tài)成像或治療［21，22］.診療一體化是目前臨床研究的一個重要目標，但現(xiàn)有的單一熒光成像系統(tǒng)僅能單純地指導化療，而化療作為一種全身性的治療手段，很難對病灶部位實施精準治療.光熱治療是目前腫瘤治療研究的熱點，將具有較高光熱轉換效率的材料富集在腫瘤組織附近，在外部激光照射下將光能轉換為熱能來殺死癌細胞，進而實現(xiàn)對腫瘤部位的靶向治療.利用紅外熱成像儀可實時監(jiān)測腫瘤治療過程中的溫度變化，具有無創(chuàng)、無損、簡便快捷等優(yōu)點.將熒光成像與熱成像結合能夠實現(xiàn)診斷和治療一體化，對疾病的早期診斷和精準治療具有重要意義［23］.

本文報道了一種小動物活體熒光-光熱雙模成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)集成了熒光成像和熱成像，其中，熒光成像部分激發(fā)光波長范圍為435～980 nm，可實現(xiàn)常見有機熒光染料分子的熒光成像和近紅外激發(fā)的上轉換發(fā)光成像，通過CMOS檢測器采集熒光圖像，成像速度快，靈敏度高；熱成像部分采用808 nm近紅外激光作為激發(fā)光源，可實現(xiàn)光熱治療，同時熱成像儀通過采集非接觸探測紅外能量將其轉換為電信號，生成熱圖像和溫度值.利用研制的小動物活體熒光-光熱雙模成像系統(tǒng)，實現(xiàn)了通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內的聚多巴胺包裹的上轉換納米探針（UCNP@PDA）的熒光成像和熱成像，同時在納米探針表面負載上化療藥物阿霉素（DOX）后，實現(xiàn)了光熱對藥物可控釋放過程的實時監(jiān)測.

1 雙模成像系統(tǒng)的構建

圖1 為研制的小動物活體熒光-光熱雙模成像系統(tǒng)的光路圖和實物照片.熒光成像部分采用反射式熒光成像方式，由發(fā)射源發(fā)射激光并通過準直鏡經(jīng)反射濾光片照射到載物臺上的小動物軀體上，其體內的熒光探針受到激發(fā)并發(fā)射出熒光光子.這些熒光光子經(jīng)生物組織吸收和散射后逸出表面，再經(jīng)過2個長通濾光片，最終被探測器捕獲，并通過采集控制軟件處理后成像.熱成像部分，當808 nm激發(fā)光經(jīng)反射濾光片照射到小動物軀體上，其體內的光熱試劑吸收近紅外光的能量并轉換為熱能，導致局部溫度升高，通過熱成像儀對照射部位的紅外輻射探測，并加以信號處理、光電轉換等將溫度分布圖像轉換成可視圖像.此外，2種成像既可獨立進行也可同時進行，即光熱過程中如有熒光信號改變，可同時采集熒光成像和熱成像.

所構建的系統(tǒng)中，近紅外激發(fā)光源（808和980 nm）采用MW-GX-808-980/5W半導體激光器（長春鐳仕光電科技有限公司定制），其激光的輻射功率連續(xù)可調，且最大輸出功率分別可達到4900 mW（808 nm）和5250 mW（980 nm）.為了使激光光斑能覆蓋實驗小鼠的主要器官和組織，在激光出口安裝一個擴束鏡，擴束后的光斑直徑約為20 mm.熒光激發(fā)光源采用HPX-2000高能連續(xù)氙燈光源，波長范圍為435～810 nm，可滿足常用有機熒光染料的激發(fā)波長.熒光成像檢測器選用高靈敏度CMOS探測器，其有效探測波長范圍為300～1000 nm，圖像分辨率為2590×2048 dpi，成像速度最快可達51 frame/s，信噪比為62.1 dB.探測器前的成像物鏡焦距為25 mm，光圈范圍為F1.8～F16.濾光片為定制的長通濾光片，光學密度大于5.0，不同濾光片對應的透射帶分別為400～700 nm，500～600 nm和600～750 nm.熱成像儀選用FLIR C2紅外熱像儀，成像視野為41°×31°，成像分辨率為80×60（4800測溫像素），溫度范圍為-10～150℃，溫度分辨率為0.1℃.載物臺采用三維移動平臺設計，可在三個維度進行調節(jié)，移動范圍為70 mm/30 mm/80 mm，以實現(xiàn)對小鼠不同部位的成像.此外，本系統(tǒng)可外接小動物麻醉機，在成像時利用異氟烷氣體麻醉劑對小鼠進行麻醉，誘導期短且安全性高.

Fig.1 Light path of imaging system(A)and photograph of imaging system(B)

2 結果與討論

2.1 成像靈敏度

為了測試該系統(tǒng)近紅外熒光成像的靈敏度，將參照文獻［24］方法合成的NaErF4∶10%Yb UCNP用于測試成像.圖2（A）為該UCNP的UCL光譜和TEM照片，可見其分散性良好、尺寸均一，平均粒徑約為（32±3.5）nm；在980 nm近紅外激光激發(fā)下，UCNP發(fā)射波長分別位于541和650 nm，且在紅光區(qū)熒光信號更強.利用搭建的熒光成像系統(tǒng)分別對濃度為5，10，15，25，50和100μg/mL的UCNP進行測試，利用Image J軟件對成像的圖片進行信號采集，并用“Intensity”代表信號的強度，再通過Image Pro Plus軟件把熒光信號進行偽彩處理.如圖2（B）和（C）所示，在激發(fā)波長為980 nm，激光功率為0.5 W/cm2，相機的曝光時間為100 ms時，隨著UCNP濃度的增加，信號逐漸增強，當濃度為5μg/mL時，仍可檢測到成像信號，且信噪比大于7.5，表明該系統(tǒng)具有較高的熒光檢測靈敏度.

Fig.2 UCL fluorescence spectrum and TEM image(inset)of UCNP(A),UCL images and pseudo-color images of UCNP at different concentrations at the excitation wavelength of 980 nm with laser power density of 0.5 W/cm2(B)and the corresponding signal intensity in(B)(C)

2.2 熒光穿透深度

為了探索該系統(tǒng)對組織的穿透能力，將不同厚度（2，4，6，8，10和12 mm）的雞胸肉分別放置在裝有0.1 mL UCNP（0.1 mg/mL）和0.1 mL DOX（0.1 mg/mL）孔板的頂部.分別采用980 nm（1.5 W/cm2）激光照射UCNP溶液，488 nm（45 mJ/脈沖）激光照射DOX溶液，采集雞胸肉切片的熒光成像圖.定義熒光信號強度為背景信號強度5倍以上時，代表其具有較好的穿透深度.如圖3（A）所示，UCNP的上轉換發(fā)光信號隨著雞肉穿透深度的增加而不斷減弱，穿透深度可以達到10 mm，說明近紅外成像具有較好的穿透深度；而對于DOX熒光成像，在雞肉厚度達到4 mm時仍可觀察到熒光信號，這一厚度可滿足小鼠皮下腫瘤和深層的組織熒光成像.

Fig.3 UCL images and pseudo-color images of UCL(A),DOX fluorescence imaging of fluorescence passed through chicken breast slices with different thicknesses(B)and the corresponding fluorescence signal intensities of(A)and(B)(C)

2.3 光熱控制藥物釋放的體外監(jiān)測

將DOX負載在納米光熱試劑上，考察了光熱對藥物的控制釋放.在UCNP表面包裹厚度為5 nm的PDA，通過共價鍵和π-π鍵作用，將DOX負載到PDA表面，得到UCNP@PDA-DOX納米復合材料，其生物安全性已得到證明［23］.取0.3 mL 5 mg/mL UCNP@PDA-DOX置于孔板中，同時采用488和808 nm激發(fā)光源照射溶液，通過熱成像儀記錄溶液溫度變化情況，同時通過熒光成像儀采集DOX熒光信號的變化.如圖4所示，當沒有808 nm激光照射時，溶液溫度不變，且監(jiān)測不到DOX的熒光信號.而當有808 nm激光（1.5 W/cm2）照射時，溶液溫度不斷上升，7 min后幾乎不再變化，最高溫度為57.9℃；在4 min開始監(jiān)測到DOX信號，此時溶液溫度為52.7℃，之后隨著溫度升高DOX熒光信號不斷增強，表明DOX在逐漸釋放.當通過808 nm近紅外激光照射溶液時，引起聚多巴胺光熱效應，加速了聚合物的降解，從而促進DOX的釋放.以上結果表明，該系統(tǒng)可實時監(jiān)測光熱對納米藥物的可控精準釋放.

Fig.4 DOX fluorescence imaging(a,d),pseudo-color images(b,e)and thermal imaging(c,f)of UCNP@PDA-DOX without(a—c)or with(d—f)808 nm near infrared laser irradiation(A)and the corresponding fluorescence signal intensities and temperature data(B)

2.4 活體近紅外熒光成像

實驗中考察了該系統(tǒng)的近紅外熒光成像效果.構建了荷瘤裸鼠（MDA-MB-231人乳腺癌細胞接種）模型，將200μL 1 mg/mL的UCNP@PDA-DOX經(jīng)尾部靜脈注射到小鼠體內，在980 nm近紅外激光照射下，分別采集小鼠腫瘤和肝臟部位在注射前后不同時間點的熒光圖像.熒光圖像經(jīng)偽彩處理后與明場照片疊加獲得，其輪廓邊緣清晰可見，成像信噪比較高.如圖5所示，小鼠腫瘤和肝臟的UCL信號不斷增強，在4 h達到最強后又逐漸減弱，表明4 h時UCNP@PDA-DOX在小鼠體內富集最多，24 h時后信號強度明顯減弱，納米探針通過肝臟代謝排出體外，表明該系統(tǒng)可用于活體腫瘤及深層組織的熒光成像，通過熒光信號的強弱可評估納米探針在腫瘤和肝臟內的富集和代謝過程.

Fig.5 UCL imaging of the tumor sites(a)and liver(circles)sites(b)at different time after injection with UCNP@PDA-DOX(A),the corresponding fluorescence signal intensities of tumor sites(B)and liver sites(C)(0 h means pre-injection)

2.5 活體光熱治療和藥物釋放監(jiān)測

使用該系統(tǒng)對荷瘤裸鼠的光熱-化療聯(lián)合治療過程進行了監(jiān)測.在納米探針UCNP@PDA-DOX注射4 h后，腫瘤部位達到最大富集量時，采用808 nm近紅外激光對腫瘤部位照射10 min，通過熱成像儀監(jiān)測腫瘤部位的溫度變化，同時采集DOX在488 nm激發(fā)下的熒光信號變化.如圖6所示，照射5 min后溫度達到45℃，能夠殺死癌細胞，實現(xiàn)光熱治療.在照射6 min后，當腫瘤部位溫度達到49℃時，開始監(jiān)測到DOX熒光，隨后信號不斷增強，表明此時DOX已經(jīng)開始在腫瘤部位大量釋放，實現(xiàn)化療.這表明該系統(tǒng)可實時監(jiān)測皮下腫瘤部位光熱控制藥物釋放的過程.

Fig.6 In vivo fluorescence images(a)and thermal images(b)of tumor sites with 808 nm NIR laser irradiation for 10 min after intravenous injection of UCNP@PDA-DOX at 4 h post-injection(A)and the corresponding fluorescence signal intensities and temperature data,respectively(B)

體外熒光穿透實驗結果表明該系統(tǒng)能監(jiān)測到4 mm深度的熒光信號，為了考察系統(tǒng)對深層組織/器官的成像能力，監(jiān)測了小鼠肝臟部位DOX釋放情況.將納米探針UCNP@PDA-DOX通過尾靜脈注射到小鼠體內4 h后，采用808 nm近紅外激光照射肝部10 min，刺激DOX釋放.如圖7所示，在照射7 min后溫度達到47℃時，監(jiān)測到肝部DOX的熒光信號，隨后逐漸增強，表明達到一定溫度后DOX在肝部開始逐漸釋放，且該系統(tǒng)能夠監(jiān)測到釋放過程.以上實驗表明，該系統(tǒng)對皮下腫瘤和深層組織/器官（比如肝臟）均能實現(xiàn)納米藥物的富集成像和可控釋放監(jiān)測，這對病變部位實施精準治療具有重要意義.

Fig.7 In vivo fluorescence images(a)and thermal image(b)of liver sites with 808 nm NIR laser irradiation for 10 min after intravenous injection of UCNP@PDA-DOX at 4 h post-injection(A)and the corresponding fluorescence signal intensities and temperature data,respectively(B)

3 結 論

將生物納米技術、分子熒光成像技術和熱成像等技術結合應用，研制出小動物活體熒光-光熱雙模成像系統(tǒng)，其集成了多波長熒光成像和熱成像，具有較高的熒光成像靈敏度、較快的采集速度（51 frame/s）和較高的圖像分辨率（2590×2048 dpi），在近紅外熒光成像時具有較大的穿透深度以及0.1℃的熱成像分辨率.將該系統(tǒng)與納米探針UCNP@PDA-DOX結合使用，可通過上轉換發(fā)光成像實時監(jiān)測探針在活體小鼠腫瘤和肝臟內的富集過程，并能夠通過808 nm激光照射對小鼠進行光熱治療，同時刺激DOX藥物釋放，利用熱成像儀記錄小鼠的溫度變化，并通過熒光成像監(jiān)測藥物的釋放過程.利用該系統(tǒng)可以對標記有特定熒光探針的生物分子、活細胞、活體小動物的器官和組織等進行成像，進而實時地觀察生物分子在活體內的表達，及腫瘤的發(fā)生、生長、轉移和藥物的治療效果等.因此，該系統(tǒng)有望在疾病的早期診斷和精準治療、藥物篩選及生命機理研究等領域得到廣泛應用.