急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌自噬和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

王平 Chun-Guang LI 崔迪 丁樹哲

1 杭州師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（杭州311121）

2 Western Sydney University NICM Health Research Institute（Penrith NSW 2751）

3 湖南大學(xué)體育學(xué)院（長沙410082）

4 華東師范大學(xué)青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海200241）

骨骼肌不僅是機(jī)體運(yùn)動(dòng)的主要器官，也是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及利用的主要場(chǎng)所，骨骼肌細(xì)胞糖代謝的變化對(duì)于整個(gè)機(jī)體糖代謝的平衡和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，也是維持骨骼肌健康乃至整個(gè)機(jī)體健康的重要前提[1]。運(yùn)動(dòng)刺激可使骨骼肌細(xì)胞糖代謝發(fā)生適應(yīng)性變化。已有研究報(bào)道，急性運(yùn)動(dòng)使野生型小鼠骨骼肌的葡萄糖吸收明顯增加、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter 4，GLUT4）轉(zhuǎn)位（從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜）明顯增加[2]。游泳運(yùn)動(dòng)明顯降低2 型糖尿病大鼠空腹血糖，增加腓腸肌GLUT4蛋白表達(dá)，改善口服糖耐量水平[3]。耐力運(yùn)動(dòng)可明顯增加代謝綜合征患者（2 型糖尿病高危人群）股外側(cè)肌GLUT4 蛋白表達(dá)[4]。運(yùn)動(dòng)有助于改善機(jī)體糖代謝平衡，有效預(yù)防胰島素抵抗、2型糖尿病、高胰島素血癥等代謝相關(guān)性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5]。但其分子機(jī)制尚不清楚。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可適度激活自噬，是維持運(yùn)動(dòng)過程中骨骼肌細(xì)胞代謝和能量穩(wěn)定，及時(shí)清除和回收胞漿中聚集代謝廢物的重要機(jī)制[1]。自噬的激活可能是介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗等骨骼肌糖代謝紊亂的重要機(jī)制之一[6]。Guo等[7]探討了自噬與胰島素抵抗之間的關(guān)系，將糖尿病大鼠足細(xì)胞小干擾RNA（small in?terfering RNA，siRNA）靶向沉默GLUT4基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLUT4 siRNA 導(dǎo)致糖尿病足細(xì)胞Ⅱ型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（type Ⅱ microtubule-associated protein light chain，LC3Ⅱ）表達(dá)顯著增加，提示GLUT4 對(duì)于自噬活性必不可少。反之，He等[2]的研究也發(fā)現(xiàn)，自噬基因缺陷（BCL2AAA，Thr69/Ser70/Ser84 磷酸化位點(diǎn)缺失）小鼠在運(yùn)動(dòng)后腓腸肌GLUT4 轉(zhuǎn)位下降、腓腸肌葡萄糖吸收減少，高脂膳食小鼠胰島素抵抗和糖代謝紊亂加重。然而，到目前為止，運(yùn)動(dòng)激活自噬在骨骼肌糖代謝中的分子機(jī)制尚不完全明確，因此，本研究采用急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)小鼠模型，觀察運(yùn)動(dòng)后0 h、6 h、12 h 和24 h 小鼠血糖、腓腸肌肌糖原含量、GLUT4 mRNA 和蛋白表達(dá)及腓腸肌自噬相關(guān)基因13（autophagy-relat?ed gene 13，Atg13）、自噬相關(guān)蛋白p62（autophagy as?sociated protein p62，p62）、溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lyso?some-associated membrane protein2，LAMP2）和微管相關(guān) 蛋 白1 輕 鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）mRNA 和蛋白表達(dá)的變化，以及GLUT4 蛋白表達(dá)與骨骼肌自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ和LAMP2 蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析，進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的分子機(jī)制，預(yù)期成果將進(jìn)一步闡明運(yùn)動(dòng)激活自噬是維持骨骼肌葡萄糖穩(wěn)態(tài)的一種重要的作用機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌糖代謝異常的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

4 周齡ICR（Institute for Cancer Research）雄性健康清潔級(jí)小鼠，由上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007- 0005，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2004-0001，常規(guī)分籠飼養(yǎng)，5 只/籠，自由攝食、自由飲水。小鼠購買后，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天，然后隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（Con 組）和急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組，隨后急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組小鼠根據(jù)運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)時(shí)間再次分為運(yùn)動(dòng)后即刻組（0 h組）、運(yùn)動(dòng)后6 h組（6 h 組）、運(yùn)動(dòng)后12 h 組（12 h 組）和運(yùn)動(dòng)后24 h 組（24 h組），每組6只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組小鼠先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練3 天（坡度為 0℃，速度為 15 m/min，持續(xù) 30 min/day）。正式運(yùn)動(dòng)參照Bedford 方案[8]，具體如下：1 級(jí)負(fù)荷為坡度0°，速度8.2 m/min，相當(dāng)于53%VO2max，持續(xù)時(shí)間15 min；2 級(jí)負(fù)荷為坡度5°，速度15 m/min，相當(dāng)于64%VO2max，持續(xù)時(shí)間15 min；3 級(jí)負(fù)荷為坡度10°，速度19.3 m/min，相當(dāng)于76%VO2max，持續(xù)至力竭。在運(yùn)動(dòng)過程中為了保持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，采用毛刷刺激，使小鼠的運(yùn)動(dòng)始終保持在跑道前1/3 。在小鼠不能繼續(xù)堅(jiān)持原來的速度，且毛刷刺激驅(qū)趕無效，停止運(yùn)動(dòng)后表現(xiàn)為俯臥位，對(duì)刺激反應(yīng)遲緩、呼吸急促，神情冷漠，此時(shí)判斷為運(yùn)動(dòng)力竭[9]。實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程中，分別記錄和計(jì)算每只小鼠跑到力竭的時(shí)間和距離，平均力竭時(shí)間為173.83 ± 13.75 min，平均距離為3.25 ± 0.91 km。

1.3 取材

運(yùn)動(dòng)組小鼠在運(yùn)動(dòng)力竭后對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采用脫頸椎法處死小鼠，迅速從心臟取血放于1.5 ml離心管（放在冰盒）靜置30 min，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，然后以10000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心10 min，離心過程采用低溫離心機(jī)（溫度為4℃），然后用移液器取出上清液，標(biāo)記好放置于－80℃冰箱保存用于生化測(cè)試；同時(shí)迅速取出腓腸肌，稱重，標(biāo)記好放入凍存管，置于液氮中，隨后轉(zhuǎn)入－80℃冰箱，用于生化和基因表達(dá)測(cè)試，安靜對(duì)照組小鼠在安靜狀態(tài)取材。

1.4 血糖和腓腸肌肌糖原的測(cè)定

血清葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法，試劑盒購自南京建成生物有限公司；腓腸肌肌糖原采用比色法，試劑盒購自武漢博士德生物公司，檢測(cè)時(shí)具體操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

冰上取腓腸肌約40 mg，在液氮中研磨后加入1 ml TRizol，采用Invitrogen Trizol 法提取腓腸肌總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)和計(jì)算總RNA 的OD260/OD280 值，采用TOYOBO FSQ101 反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，ABI StepOne 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Atg13、LAMP2、LC3、p62 和GLUT4 的mRNA 表達(dá)量，熒光染料為TOYOBO QPK201 SYBR GREEN。根據(jù)PCR 儀給出各反應(yīng)孔的Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算各樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)量，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.6 免疫印跡法（Western Blot）

取腓腸肌約50 mg 在冰上剪碎放入研磨管中，加入RIPA裂解液于OMINI Bead Ruptor 24 型磁珠勻漿機(jī)勻漿，然后15000 rpm離心15 min取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，使用空白裂解液稀釋樣本至統(tǒng)一濃度，然后加5×上樣緩沖液，混勻，95℃加熱5分鐘，冷卻后待用。電泳時(shí)，上樣量總蛋白為30 μg。依據(jù)目的蛋白的分子量制備分離膠濃度為8%、10%或12%，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜；轉(zhuǎn)膜后將膜使用5%脫脂奶粉封閉1 h。用1% BSA/PBST 稀釋一抗（Atg13 1︰1000，Cell Signaling Technology，USA；LAMP2 1︰1000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.；p62 1︰1000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.；LC3Ⅱ1︰1000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.；LC3Ⅰ 1︰1000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.；GLUT4 1︰1000，Santa Cruz Bio?technology，Inc.；和β-tubulin 1︰1000，Santa Cruz Bio?technology，Inc.），4℃孵育過夜。次日，PBST 洗滌3 次，每次10 min，然后加入HRP 標(biāo)記二抗（1︰5000，Pro?teintech）室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次后顯影，顯影試劑盒為Millipore ECL 超敏試劑盒，凝膠成像系統(tǒng)（Al?phaFC2型）進(jìn)行冷光掃膜，F(xiàn)luorChem FC2軟件對(duì)捕捉圖像進(jìn)行灰度值分析，內(nèi)參為β-tubulin。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件處理，每組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；相關(guān)性分析采用線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r和P值。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因Atg13、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62 和LAMP2 的蛋白和mRNA表達(dá)的影響

與Con 組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h 組、6 h 組、12 h 組和24 h組小鼠腓腸肌Atg13蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)后0 h組腓腸肌Atg13 mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.01），而6 h 組、12 h 組和24 h 組腓腸肌Atg13 mRNA 表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）（圖1）。

圖1 各組小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因Atg13表達(dá)變化

與Con組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h組小鼠腓腸肌LC3Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均顯著增加（P<0.01），6 h 組、12 h組和24 h組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)后0 h組小鼠腓腸肌LC3 mRNA 表達(dá)顯著增加（P<0.05），雖然6 h組、12 h 組和24 h 組腓腸肌LC3 的mRNA 表達(dá)均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，但均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）（圖2）。

圖2 各組小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)變化

與Con 組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h 組、6 h 組、12 h 組和24 h 組小鼠腓腸肌LAMP2 蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性增加（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)后0 h 組腓腸肌LAMP2 mRNA 表達(dá)極顯著增加（P<0.01），6 h組、12 h組和24 h組腓腸肌LAMP2 mRNA 表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）（圖3）。

圖3 各組小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因LAMP2表達(dá)變化

與Con組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h組、12 h組和24 h組小鼠腓腸肌p62 蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.01 或P<0.05），6 h 組腓腸肌p62 蛋白表達(dá)未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）；運(yùn)動(dòng)后24 h 組小鼠腓腸肌p62 mRNA 表達(dá)極顯著增加（P<0.01），0 h 組、6 h 組和12 h 組腓腸肌p62 mRNA表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）（圖4）。

圖4 各組小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因p62表達(dá)變化

2.2 急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腓腸肌GLUT4 蛋白和mRNA表達(dá)的影響

與Con組相比，運(yùn)動(dòng)后6 h組、12 h組和24 h組小鼠腓腸肌GLUT4 mRNA 和GLUT4 蛋白表達(dá)均出現(xiàn)顯著性增加（P<0.05 或P<0.01），但0 h 組腓腸肌GLUT4 mRNA 和GLUT4 蛋白表達(dá)均未出現(xiàn)顯著性變化（P>0.05）（圖5）。

圖5 各組小鼠腓腸肌GLUT4表達(dá)變化

2.3 急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠血糖和腓腸肌肌糖原含量的影響

與Con 組相比，運(yùn)動(dòng)后0 h 組、6 h 組、12 h 組和24 h組血糖均出現(xiàn)極顯著下降（P<0.01），0 h組下降尤為明顯，隨后恢復(fù)期血糖水平逐漸回升，恢復(fù)到12 h達(dá)到最高水平；運(yùn)動(dòng)后0 h 組、6 h 組腓腸肌肌糖原含量均顯著下降（P<0.01），但12 h組和24 h組腓腸肌肌糖原含量均未出現(xiàn)顯著性差異（P>0.05）（圖6）。

圖6 各組小鼠血糖和腓腸肌肌糖原含量的變化

2.4 GLUT4 與自噬相關(guān)基因LC3Ⅱ和LAMP2 的相關(guān)性分析

小鼠腓腸肌GLUT4 蛋白表達(dá)分別與LC3 Ⅱ、LAMP2 蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)（r=0.6709，P<0.01；r=0.5705，P<0.01）（圖7）。

圖7 小鼠腓腸肌GLUT4蛋白表達(dá)分別與LC3Ⅱ、LAMP2蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Atg13和LAMP2表達(dá)的影響

自噬對(duì)于細(xì)胞的存活、分化、發(fā)育和細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要，是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制和維持細(xì)胞能量和氨基酸穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制[10，11]。自噬的功能依賴于細(xì)胞質(zhì)中的自噬體[6]。自噬體的標(biāo)志性蛋白是LC3，它的來去是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程：LC3 在羧基端（carboxyl termi?nus，C 端）被自噬相關(guān)基因4（autophagy related gene 4，Atg4）剪切，形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ通過自噬相關(guān)基因7（autophagy related gene 7，Atg7）和自噬相關(guān)基因3（autophagy related gene 3，Atg3）分別在泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）和泛素結(jié)合酶（ubiq?uitin-conjugating enzyme，E2）的作用下被泛素化，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，生成LC3Ⅱ，附著在自噬體膜上，成為哺乳動(dòng)物自噬體形成的生化標(biāo)志物[12]。而且LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ已被廣泛作為間接檢測(cè)自噬體形成的生化標(biāo)志物[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的小鼠，當(dāng)運(yùn)動(dòng)到60～90 min 時(shí)，其腓腸肌LC3Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加[14]。Liu[15]等也發(fā)現(xiàn)1 小時(shí)的急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使小鼠骨骼肌LC3Ⅱ表達(dá)明顯增加，60～120 min的急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可使小鼠骨骼肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ顯著增加。本研究結(jié)果顯示，遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)力竭后即刻（0 h）小鼠腓腸肌LC3Ⅱ的mRNA、蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)均顯著增加，提示急性運(yùn)動(dòng)可激活自噬體的形成過程，LC3Ⅱ的表達(dá)或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可以作為運(yùn)動(dòng)后即刻自噬反應(yīng)的敏感指標(biāo)，而運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期的6 h、12 h 和24 h 均未發(fā)生顯著變化。但也有相反的報(bào)道，有人將ICR 小鼠進(jìn)行50 min 急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（速度為12.3 m/min，坡度為5°），結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3Ⅱ蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻（0 h）未顯著增加，但在運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期的3 h、6 h和12h 均顯著降低[16]；也有人以50%VO2max 的強(qiáng)度進(jìn)行急性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，當(dāng)跑到30 min 甚至120 min 后即刻（0 h）都未見小鼠腓腸肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表達(dá)增加[17]。分析造成上述結(jié)果不一致的原因，可能是由于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的不同、運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間不同和運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期取材時(shí)間的不同造成的。Fritzen 等為了排除LC3Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ未發(fā)生變化是由于肌肉運(yùn)動(dòng)不足造成的，采用超級(jí)電生理刺激甚至劇烈的電刺激反復(fù)刺激肌肉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腓腸肌LC3Ⅱ蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ還是未發(fā)生顯著變化，故質(zhì)疑只用LC3Ⅱ蛋白表達(dá)作為肌肉受到機(jī)械刺激變化的唯一指標(biāo)的合理性，建議增加雙熒光mRFP-eGFP-LC3自噬指示體系[18]，以便更有利于監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的自噬[17]。

需要強(qiáng)調(diào)的是，自噬體的含量不僅與自噬體的形成有關(guān)，還與溶酶體降解有關(guān)[13]。p62是一種反應(yīng)自噬溶酶體降解的蛋白，可與LC3直接結(jié)合，募集其他蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬溶酶體進(jìn)行降解過程，p62蛋白表達(dá)下降提示自噬活性增加[19]。Lenhare[20]等研究發(fā)現(xiàn)，急性游泳運(yùn)動(dòng)明顯降低老年小鼠腓腸肌p62蛋白表達(dá)。He也報(bào)道，一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使小鼠腓腸肌p62 蛋白表達(dá)顯著下降[21]。本研究結(jié)果顯示，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后0 h p62 蛋白表達(dá)顯著下降，于運(yùn)動(dòng)后6 h 出現(xiàn)短暫回升、然后于12 h 一直持續(xù)到24 h 均維持在低水平狀態(tài)，提示p62 蛋白對(duì)急性運(yùn)動(dòng)反應(yīng)早，且延續(xù)時(shí)間較長，可作為一次性力竭運(yùn)動(dòng)后反應(yīng)自噬活性的敏感性指標(biāo)。但p62 mRNA 表達(dá)于運(yùn)動(dòng)后24 h 出現(xiàn)顯著增加，與蛋白表達(dá)不一致，分析其原因可能與啟動(dòng)子激活或增強(qiáng)子激活，或與上游轉(zhuǎn)錄因子激活有關(guān)[22]。但關(guān)于其分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

本研究中為了進(jìn)一步監(jiān)測(cè)自噬發(fā)生的變化，我們還檢測(cè)了腓腸肌自噬基因Atg13表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后0 h 小鼠腓腸肌Atg13 mRNA 表達(dá)顯著增加。自噬因子Atg13 是自噬體膜發(fā)生和形成的關(guān)鍵基因，與unc-51 樣自噬激活激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）和分子量大小為200 kD 的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kDa，F(xiàn)IP200）共同形成復(fù)合物，負(fù)責(zé)自噬的啟動(dòng)過程[23]。正常情況下，磷酸化的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）阻止ULK1、FIP200 與Atg13 形成復(fù)合物，抑制自噬活性[23]，但運(yùn)動(dòng)可使mTOR 的磷酸化水平下降，促進(jìn)ULK1、FIP200 與Atg13復(fù)合物的形成，激活腓腸肌自噬[24]。但本研究結(jié)果顯示急性遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)并沒有使腓腸肌Atg13 的蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著變化，分析Atg13 mRNA 和蛋白表達(dá)不一致的可能原因：（1）為了避免自噬其他相關(guān)基因的耗竭，Atg13 基因在轉(zhuǎn)錄延伸階段發(fā)生了部分消耗[25]；（2）與復(fù)雜的生物學(xué)過程有關(guān)，譬如轉(zhuǎn)錄剪接、轉(zhuǎn)錄后剪接，翻譯修飾，翻譯調(diào)控和蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成等均可能影響mRNA 和蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)[26]，因此急性運(yùn)動(dòng)對(duì)腓腸肌Atg13表達(dá)的影響還需要進(jìn)一步探索。

LAMP2是位于溶酶體膜且含量最高的一種特異蛋白，其作用在自噬起始階段誘導(dǎo)自噬的發(fā)生、在自噬溶酶體階段負(fù)責(zé)降解過程[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，抗阻運(yùn)動(dòng)明顯增加老年人外周血單核細(xì)胞自噬相關(guān)基因LAMP2、自噬相關(guān)蛋白12（autophagy related protein 12，Atg12）和自噬相關(guān)基因16（autophagy related gene，Atg16）蛋白表達(dá)，增強(qiáng)自噬，改善老年人抗炎和抗凋亡能力[28]；耐力運(yùn)動(dòng)明顯增加老年人神經(jīng)元LAMP2 的蛋白表達(dá)，減弱老年人神經(jīng)退行性改變，改善老年癡呆癥狀[29]，耐力運(yùn)動(dòng)可明顯增加腓腸肌LAMP2 mRNA 表達(dá)，增強(qiáng)腓腸肌自噬，降低大鼠高血壓[30]。但也有相反的報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)（80%～85%最大心率的強(qiáng)度）并沒有使老年人和青年人外周血單核細(xì)胞自噬相關(guān)基因LAMP2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯變化[31]。目前急性運(yùn)動(dòng)對(duì)腓腸肌LAMP2 蛋白表達(dá)的研究較少，本研究結(jié)果顯示，急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后0 h 小鼠腓腸肌LAMP2 mRNA表達(dá)增加，但LAMP2蛋白表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化，可能原因：（1）由mRNAs 和蛋白的穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率不同造成的[32]；（2）與轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的蛋白調(diào)控有關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，同一基因的mRNA 和蛋白表達(dá)不一定同步[33]，同步率只達(dá)到0.46～0.68[34]。

3.2 運(yùn)動(dòng)激活自噬對(duì)小鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

眾所周知，Glut4（又稱Slc2a4）基因主要存在于人類骨骼肌中，GLUT4蛋白是一種跨膜蛋白，是骨骼肌攝取葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體，也是維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素[35，36]。目前研究證實(shí)，2型糖尿病小鼠中，骨骼肌GLUT4 蛋白表達(dá)下降，葡萄糖攝取和利用能力下降[37]。腓腸肌Glut4過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠可明顯增加腓腸肌葡萄糖攝取和利用能力，拮抗胰島素抵抗[38]，提示Glut4基因是抑制腓腸肌胰島素抵抗的關(guān)鍵基因，增強(qiáng)Glut4基因表達(dá)對(duì)于防治胰島素抵抗具有重要意義。有趣的是，最近有研究發(fā)現(xiàn)，自噬可調(diào)控GLUT4 蛋白的轉(zhuǎn)位（從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜）和GLUT4 儲(chǔ)存囊泡的釋放[39]，因此，通過自噬過程靶向調(diào)節(jié)GLUT4的轉(zhuǎn)位和再循環(huán)對(duì)于預(yù)防和治療2 型糖尿病至關(guān)重要。Yang[40]研究發(fā)現(xiàn)，自噬基因缺陷小鼠骨骼肌細(xì)胞膜GLUT4 表達(dá)下降、葡萄糖吸收減少、葡萄糖耐受降低、高脂膳食小鼠胰島素抵抗和糖代謝紊亂加重。He[2]也發(fā)現(xiàn)腓腸肌特異性自噬缺陷小鼠GLUT4的轉(zhuǎn)位明顯下降，且葡萄糖耐受降低，糖代謝紊亂，更值得注意的是，不管是急性運(yùn)動(dòng)還是耐力運(yùn)動(dòng)均不能改善由于自噬缺陷導(dǎo)致的糖代謝紊亂，甚至加重糖代謝紊亂。因此，自噬對(duì)于運(yùn)動(dòng)過程中骨骼肌糖代謝穩(wěn)定是必須的。本研究結(jié)果顯示，急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后6 h 腓腸肌GLUT4 mRNA 和蛋白表達(dá)均出現(xiàn)顯著性增加，此效應(yīng)一直持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)，提示急性運(yùn)動(dòng)引起的GLUT4蛋白表達(dá)反應(yīng)相對(duì)滯后但持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長。結(jié)合上述本研究結(jié)果腓腸肌自噬基因LC3II、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Atg13和LAMP2表達(dá)明顯增加或p62蛋白表達(dá)明顯下降的時(shí)間均為急性運(yùn)動(dòng)后0 h，提示急性運(yùn)動(dòng)觸發(fā)腓腸肌自噬相關(guān)基因的表達(dá)明顯早于GLUT4 的表達(dá)，但持續(xù)時(shí)間較短，推測(cè)也許運(yùn)動(dòng)源性自噬是運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能增強(qiáng)的一種分子機(jī)制。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，腓腸肌GLUT4 蛋白表達(dá)與自噬相關(guān)基因LC3 Ⅱ、LAMP2 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ和LAMP2 的蛋白表達(dá)可能與骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)。關(guān)于自噬與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的分子生物學(xué)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后0 h血糖含量顯著降低，血糖降低一直持續(xù)到恢復(fù)后24 h，血糖降低的趨勢(shì)基本與骨骼肌GLUT4 表達(dá)增加的趨勢(shì)一致。這提示，運(yùn)動(dòng)過程中，一方面運(yùn)動(dòng)促進(jìn)骨骼肌GLUT4表達(dá)，將血液中更多的葡萄糖攝入細(xì)胞內(nèi)，維持骨骼肌能量需求[41]；另一方面運(yùn)動(dòng)激活自噬，自噬進(jìn)一步促進(jìn)GLUT4的表達(dá)，增強(qiáng)葡萄糖攝取入細(xì)胞內(nèi)，血液葡萄糖下降[42]。同樣，在運(yùn)動(dòng)過程中，肌糖原也是糖類化合物（carbohy?drate ，CHO）代謝的主要來源[21]，James 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后0 h大鼠腓腸肌肌糖原含量顯著下降。本研究結(jié)果也顯示，運(yùn)動(dòng)后0 h 小鼠腓腸肌肌糖原含量顯著降低。提示，一次性力竭運(yùn)動(dòng)中肌糖原分解供能，這樣既能滿足骨骼肌運(yùn)動(dòng)時(shí)大量能量的需求，又有助于骨骼肌迅速按照細(xì)胞需求調(diào)整ATP 的合成速率和能量底物的種類，為骨骼肌能量代謝提供穩(wěn)定的能源物質(zhì)，使骨骼肌具有很高的能量代謝可塑性，很快適應(yīng)環(huán)境變化，增強(qiáng)骨骼肌功能，有利于整個(gè)機(jī)體健康[44]。

4 小結(jié)

急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可明顯增加小鼠腓腸肌自噬相關(guān)基因Atg13、LAMP2 和LC3 mRNA 表達(dá)、LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)、明顯降低p62 蛋白表達(dá)，增強(qiáng)骨骼肌自噬；不同自噬指標(biāo)對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)時(shí)間和激活后延遲的時(shí)間基本一致；急性遞增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)明顯提高小鼠腓腸肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，腓腸肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的增加與自噬相關(guān)因子LC3Ⅱ和LAMP2蛋白的表達(dá)顯著正相關(guān)。這種運(yùn)動(dòng)和骨骼肌自噬的關(guān)聯(lián)可能是急性運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)小鼠骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的重要分子機(jī)制之一。