雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)抗體ELISA 檢測(cè)方法的建立

田崇瑜，段小超，陳彥華，霍乃蕊，韓克光，古少鵬，鄭明學(xué)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西安弘檢測(cè)技術(shù)有限公司，山西太原 030008）

雞球蟲(chóng)在養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在[1]并隨時(shí)可能形成循環(huán)感染[2]，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。雞球蟲(chóng)病由艾美爾屬球蟲(chóng)寄生在腸上皮細(xì)胞引發(fā)，尤以寄生在盲腸的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria tenella）致病性最強(qiáng)[3]。雞只攝入環(huán)境中的孢子化卵囊而感染，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)雞只大批死亡，輕癥或痊愈雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻，對(duì)其他傳染病易感，產(chǎn)蛋率下降、料肉比增加，并且對(duì)新城疫、法氏囊、傳支等形成免疫抑制[4]。近年雞球蟲(chóng)病呈現(xiàn)出一些新的變化[2]，表現(xiàn)出向小齡化發(fā)展、發(fā)病率和死亡率高、發(fā)病常年化、癥狀溫和、耐藥性增強(qiáng)、一般的消毒劑不起作用[5]等新的特征，給養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[4]。

雞球蟲(chóng)特異性抗體檢測(cè)技術(shù)將促進(jìn)攻蟲(chóng)后的抗體應(yīng)答機(jī)制研究[6]和該病的免疫防控[7]。卵黃抗體防治雞球蟲(chóng)病效果顯著[8]，是一種無(wú)藥物殘留、安全可靠、綠色環(huán)保的球蟲(chóng)病防治新途徑[9]，雞球蟲(chóng)抗體檢測(cè)技術(shù)的建立將有助于口服卵黃抗體制劑的研發(fā)[10]。

本研究以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊接種雛雞制備陽(yáng)性血清和可溶性抗原，優(yōu)化最佳抗原包被濃度、包被條件、最佳血清稀釋度、酶標(biāo)二抗工作濃度等，從而建立柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性抗體的ELISA 檢測(cè)技術(shù)，為相應(yīng)試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試40 只5 日齡健康雛雞購(gòu)自太谷某種雞廠。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊、部分陽(yáng)性血清及純化的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性IgG（13.4 μg/mL），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭明學(xué)教授惠贈(zèng)。

1.2 試劑與儀器

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、顯色劑TMB 和Tween-20 為Sigma 產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)品雞IgG 和兔抗雞IgG-HRP 購(gòu)自北京博雅宏興科技發(fā)展有限公司。PBST 為磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 值為7.4）中加入0.5 mL Tween-20 等。

UV-2000 紫外/ 可見(jiàn)分光光度計(jì)（Unico，美國(guó)）、JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）和SpectraMax M5 多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國(guó)）等。

1.3 方法

1.3.1 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)陰性血清和陽(yáng)性血清的制備 將40 只5 日齡健康雛雞在無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境中飼養(yǎng)，飲用水為涼白開(kāi)，制備陰性和陽(yáng)性血清前連續(xù)鏡檢糞便7 d，要求不能觀察到球蟲(chóng)卵囊，采血制備20 份陰性血清。3 周齡無(wú)球蟲(chóng)雛雞用柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊口服免疫，首免劑量為1×104個(gè)/羽，10 d 后二免，劑量為5×104個(gè)/羽，再隔7 d 三免，劑量為5×104個(gè)/羽。第三免7 d 后，強(qiáng)化免疫，劑量為5×104個(gè)/羽，7d 后采血，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)，達(dá)到1∶16 以上時(shí)大量采血[11]。大量采血前禁食12 h，將采的血放置于37 ℃1 h，然后置4 ℃30 min，取出后2 500 r/min 離心20 min，血清分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體 用0.01 mol/L PBS（pH 值7.4）制備1.5%的瓊脂糖凝膠，厚度為2.5～3.0 mm，凝固后梅花打孔器打孔，挑出孔中瓊脂，封底，中間孔加入柔嫩艾美耳球蟲(chóng)可溶性抗原，外周孔1 加入已知陽(yáng)性血清，新制備的陽(yáng)性血清32、64、128 倍稀釋后依次加入孔2、孔3 和孔4，孔5 和孔6 加入制備的陰性血清。37 ℃濕盒中反應(yīng)72 h，出現(xiàn)沉淀線為陽(yáng)性，無(wú)沉淀線則為陰性。

1.3.3 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)可溶性抗原的制備 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊經(jīng)超聲破碎后反復(fù)凍融處理，10 000 r/min 低溫高速離心30 min，收集上清液，用紫外分光光度計(jì)分別在260、280 nm 處測(cè)OD值，按公式（1）計(jì)算可溶性抗原含量（以蛋白質(zhì)計(jì)）。

蛋白質(zhì)含量（mg/mL）＝（1.45×OD280－0.74×OD260）×稀釋倍數(shù) （1）

1.3.4 ELISA 操作流程 可溶性抗原包被酶標(biāo)板并用3%BSA（pH 值7.4）封閉，加樣前血清用含1%BSA 的PBST 稀釋至不同濃度，同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃孵育40 min；稀釋兔抗雞IgG-HRP 并加樣37 ℃孵育40 min；加TMB 工作液顯色，37 ℃避光反應(yīng)30 min，用2 mol/LH2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450。ELISA 過(guò)程中每步的加樣量為100 μL，每步操作前用PBST 洗板3 次，每次3 min。

1.3.5 酶標(biāo)板均一性檢驗(yàn) 隨機(jī)抽取8 條酶標(biāo)板，測(cè)定各孔空白OD450值，用稀釋1 000 倍的酶標(biāo)二抗4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板，加底物避光顯色，終止反應(yīng)，測(cè)定并計(jì)算各孔間的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.3.6 ELISA 反應(yīng)條件的確定

1.3.6.1 酶標(biāo)二抗工作濃度的確定 用質(zhì)量濃度分別為1.25、1.20、1.15、1.00 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品雞IgG 包被反應(yīng)板，用稀釋250、500、1 000 倍的兔抗雞酶標(biāo)二抗分別與雞IgG 孔反應(yīng)，每個(gè)組合做2 個(gè)平行，取能夠與最大稀釋度IgG 反應(yīng)且OD450平均值為1.0 左右的最大酶標(biāo)抗體稀釋度作為其工作濃度。

1.3.6.2 抗原最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的選擇

吸取20 μL 可溶性抗原（858.35 μg/mL）加入第1 孔，加180 μL0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）10 倍稀釋，以后各孔分別加稀釋液100 μL，從第1 孔吸取100μL加入第2 孔，反復(fù)吹吸后，吸取100μL加入第3 孔，依次操作，最后從第4 孔取100 μL 棄掉，4 ℃靜置12 h。將陽(yáng)性血清和陰性血清分別進(jìn)行10、20、40、80、100 倍稀釋，進(jìn)行方陣ELISA，以陽(yáng)性血清OD 值（P 值）與陰性血清OD 值（N 值）的比值（P/N 值）最大、陽(yáng)性血清OD450接近1 的抗原最大稀釋倍數(shù)為抗原最佳稀釋濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.3.6.3 包被液和包被條件的選擇 分別以0.01mol/L PBS（pH 值7.4）、0.05 mol/L Na2CO3-NaHCO3（CBS，pH 值9.6）、生理鹽水作包被液，抗原質(zhì)量濃度為21.46 μg/mL，4 ℃包被12 h，陽(yáng)性血清稀釋20 倍，酶標(biāo)二抗稀釋500 倍，進(jìn)行ELISA，測(cè)定OD450，選擇最佳包被液。

用0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）稀釋可溶性抗原至21.46 μg/mL，每孔加入100 μL 分別在以下條件進(jìn)行包被：37 ℃/6 h、37 ℃/2 h、4 ℃/16 h、4 ℃/12 h，然后按1.3.4 進(jìn)行ELISA，以抗原包被孔出現(xiàn)最大P/N 值時(shí)的包被條件最佳。

1.3.6.4 封閉時(shí)間的確定 每孔加100 μL 3%BSA，37 ℃分別封閉60、90、120、150 min，包被條件為4 ℃/16 h，其余操作同1.3.4，以P/N 值最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的封閉時(shí)間為最佳封閉時(shí)間。

1.3.7 陰、陽(yáng)性臨界值的確定 抽取20 份陰性血清在上述確定的ELISA 條件下反應(yīng)，計(jì)算OD450的平均值（x）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），若樣品的OD450＞x＋3S，判定為陽(yáng)性，若OD450＜x＋2S，則判定為陰性，中間值為可疑[12]。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以制備的可溶性抗原包被反應(yīng)板，將純化柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性IgG（13.4 μg/mL）作為一抗并作1～14 倍稀釋，按照本研究確定的ELISA 條件反應(yīng)，以O(shè)D450為橫坐標(biāo)、特異性IgG 濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并建立回歸方程。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 軟件處理并作圖。ELISA 反應(yīng)結(jié)果OD450值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P 值和N值的平均值計(jì)算P/N 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性抗原含量的測(cè)定

所制備的可溶性抗原的OD280和OD260平均值分別為0.488 5 和0.308 5，按公式（1）計(jì)算，可溶性抗原中的蛋白含量為858.35 μg/mL。

2.2 陰性和陽(yáng)性血清的檢測(cè)

由圖1 可知，陽(yáng)性血清對(duì)照（孔1）和新制備的陽(yáng)性血清（孔2）與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)可溶性抗原孔之間均出現(xiàn)了明顯的白色沉淀線，而陰性血清（孔5和孔6）則沒(méi)有，說(shuō)明所制備的高免陽(yáng)性血清和陰性血清均可用于后續(xù)ELISA 方法的建立。

2.3 酶標(biāo)板均一性測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，酶標(biāo)板的變異系數(shù)為1.52%，小于10%，表明該可拆開(kāi)式聚苯乙烯酶標(biāo)板符合ELISA 實(shí)驗(yàn)的要求，可保證檢測(cè)結(jié)果的有效性和穩(wěn)定性。

2.4 酶標(biāo)二抗工作濃度的測(cè)定

從表1 可以看出，當(dāng)酶標(biāo)抗體稀釋500 倍時(shí)，與不同濃度的雞IgG 反應(yīng)，OD450均接近1，故選用此稀釋倍數(shù)。

表1 不同稀釋倍數(shù)兔抗雞IgG-HRP 與雞IgG反應(yīng)的ELISA 結(jié)果（OD450）

2.5 抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定

方陣ELISA 結(jié)果表明（表2），抗原包被質(zhì)量濃度為21.46 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為20 時(shí)，P 值接近1，且P/N 值也較高，故選擇稀釋20 倍作為ELISA反應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)。

表2 不同抗原包被濃度與不同稀釋倍數(shù)血清的方陣ELISA 結(jié)果（OD450）

2.6 包被液和包被條件的選擇

從表3 可以看出，用PBS 和生理鹽水作為包被液，OD 值僅為碳酸鹽緩沖液的1/3，而空白對(duì)照孔OD 值基本一致。因此，選擇0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）為包被液。

表3 不同包被液的ELISA 結(jié)果（OD450）

以0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）作包被液，由表4 可知，在不同的溫度和時(shí)間下，N 值變化不大，4 ℃包被16 h 時(shí)，P 值接近1，且P/N 值最大，所以，選擇的最佳包被條件為4 ℃放置16 h。

表4 抗原最適包被溫度和時(shí)間的確定（OD450）

2.7 封閉時(shí)間的確定

由表5 可知，P 值接近1，且P/N 值最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的封閉時(shí)間為120 min。

表5 封閉不同時(shí)間的ELISA 檢測(cè)結(jié)果（OD450）

2.8 陰、陽(yáng)性臨界值的確定

經(jīng)測(cè)定和計(jì)算，20 份陰性血清樣品的OD450平均值（）為0.108，標(biāo)準(zhǔn)差（S）為0.006 5，如果OD450＞0.127 5（+3S），結(jié)果判為陽(yáng)性；如果OD450＜0.121（+3S），結(jié)果判為陰性，中間值為可疑。

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性IgG 建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）可知，在0.007～13.4 μg/mL 范圍內(nèi)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)特異性IgG 含量（y）與OD450（x）的關(guān)系為：y＝5.151 8x2－4.763 4x＋1.004 4，相關(guān)系數(shù)為0.992 1。

3 結(jié)論與討論

柔嫩艾美耳球蟲(chóng)是雞球蟲(chóng)病中最常見(jiàn)的一種，其突出特點(diǎn)是致病性強(qiáng)而免疫原性弱[13]，所以，一旦雞群對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)產(chǎn)生了保護(hù)力，就可判定對(duì)其他蟲(chóng)株也產(chǎn)生了保護(hù)作用，這也是本研究以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)為研究對(duì)象，建立其特異性IgG ELISA 檢測(cè)方法的原因，一方面可為球蟲(chóng)疫苗免疫效力評(píng)價(jià)提供有效監(jiān)測(cè)手段，另一方面也有利于研究球蟲(chóng)的體液免疫應(yīng)答機(jī)制。IgG 在球蟲(chóng)免疫中發(fā)揮著重要作用[13]，檢測(cè)球蟲(chóng)抗體的方法有瓊脂糖擴(kuò)散法和Dot-ELISA[14]，但這2 種方法不能對(duì)IgG 精確定量。ELISA 檢測(cè)方法是一種具有高靈敏度的定量分析技術(shù)。學(xué)者們分別以原核表達(dá)的雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)重組蛋白例如微線體蛋白4[12]、λMzp5-7 蛋白[11]等作為包被抗原建立ELISA 檢測(cè)方法，雖然包被抗原易制，但在實(shí)際檢測(cè)中需要去除待檢血清中的大腸桿菌抗體，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。還有人用減毒蟲(chóng)株[15]的可溶性卵囊抗原以及直接以弱毒四價(jià)活疫苗[6]等作為包被抗原建立ELISA 檢測(cè)方法，每種建立的方法包被抗原濃度、包被緩沖液、封閉液及封閉時(shí)間、血清稀釋度和酶標(biāo)抗體的工作濃度等參數(shù)都有所不同，所使用的酶標(biāo)二抗也不盡一樣。

本試驗(yàn)研究結(jié)果采用陰性血清OD450平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差（0.127 5）作為陽(yáng)性血清的臨界值，陰性臨界值為OD450平均值加2 倍標(biāo)準(zhǔn)差（0.121），置信度為99%，即高于0.127 5 和低于0.121 為陽(yáng)性血清和陰性血清的可能性為99%[16-18]。

本研究建立了雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)抗體的ELISA 檢測(cè)方法，以0.05 mol/L 的碳酸鹽緩沖液（pH 值9.6）稀釋可溶性抗原至21.46 μg/mL，4 ℃包被16 h；3%牛血清白蛋白37 ℃封閉2 h；待檢血清和兔抗雞IgG-HRP 的最佳稀釋倍數(shù)分別為20 倍和500 倍，陰性和陽(yáng)性結(jié)果判定的臨界OD450值分別為0.127 5 和0.121。該方法的建立有助于相應(yīng)檢測(cè)試劑盒的研發(fā)并可促進(jìn)雞球蟲(chóng)病的有效防控。