Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ在良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎和惡性變葡萄胎中的表達(dá)及意義

韋嬋妍 黃瓊?cè)A

葡萄胎是來源于受精卵的異常受精，是一類良性的妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。╣estational trophoblastic disease，GTD），多數(shù)葡萄胎在吸宮后病灶自然消退，但是具有一定的惡變潛能，能發(fā)展成為侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌、上皮樣滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等［1-3］。關(guān)于葡萄胎惡變的機(jī)制仍不明確，目前臨床上主要通過檢測葡萄胎清宮術(shù)后血人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）水平來預(yù)測葡萄胎惡變，但葡萄胎清宮術(shù)后hCG 隨訪不能嚴(yán)格執(zhí)行，且hCG 隨訪具有時間滯后性，部分葡萄胎患者確診惡變時已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至是子宮破裂［4-5］。因此對于首次清宮術(shù)診斷葡萄胎的患者，如何判斷其預(yù)后及轉(zhuǎn)歸是亟待解決的難題。近年來研究［6］顯示，葡萄胎惡變與Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控有關(guān)，Wnt 信號通路相關(guān)蛋白可能是預(yù)測葡萄胎轉(zhuǎn)歸的潛在標(biāo)志物，但目前相關(guān)系統(tǒng)研究尚缺乏。本研究檢測葡萄胎首次清宮組織中Wnt/Ca2+通路的相關(guān)蛋白無翅型MMTV 整合位點家族成員5a（wingless-type MMTV integration site family,member 5A，Wnt-5a）、無翅型MMTV 整合位點家族成員（wingless-type MMTV integration site family member，Wnt-11）及Ca2+/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ（Ca2+-calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）表達(dá)，并探討其預(yù)測葡萄胎惡變的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選 取2009年3月至2020年3月 本院72例葡萄胎患者為研究對象，平均年齡（32.84±6.42）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合葡萄胎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，并經(jīng)病理確診；②臨床病理資料完整；③年齡18～45 歲。④所有患者均知情并同意；排除標(biāo)準(zhǔn)：①清宮前接受化療的患者；②隨訪時間不足6 個月者。入選的72例葡萄胎患者中，28例隨訪發(fā)生惡變（惡變葡萄胎組），44例為隨訪未發(fā)生惡變（良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎組）；收集所有患者首次清宮石蠟標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

兔抗人Wnt-5a、Wnt-11 抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人CaMKⅡ抗體（（英國abcam 公司），Envision 法免疫組織化學(xué)試劑盒（丹麥DAKO 公司），DAB 顯色試劑盒（丹麥DAKO 公司），羊抗兔IgG 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 檢測方法

免疫組化染色及判定標(biāo)準(zhǔn)石蠟包埋的組織標(biāo)本4 μm 連續(xù)切片至過膠玻片上，56℃條件下烤片2 h，使用二甲苯連續(xù)脫蠟3 次，梯度乙醇脫二甲苯，水洗。0.3%過氧化氫室溫孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。采用免疫組化Envision 法染色，染色步驟嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行，采用DAB顯色，嚴(yán)格控制顯色時間，常規(guī)脫水、封片。使用已知陽性切片作為陽性對照，PBS 替代Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ一抗作為陰性對照。顯微鏡下隨機(jī)選取5 個切片視野（×200），再從各視野中觀察100 個細(xì)胞，采用病理Path 軟件分析顯微鏡下細(xì)胞分布情況。Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ均定位于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比對其表達(dá)情況進(jìn)行判讀［8］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用n（%）表示，采取χ2檢驗；葡萄胎惡變的獨立危險因素采用多因素Logistic 回歸模型分析；應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）評價各指標(biāo)的診斷效能，AUC 比較使用Z檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表達(dá)比較

惡變葡萄胎組Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白陽性表達(dá)率均顯著高于良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 惡變葡萄胎組和良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎組臨床特征比較

年齡、卵巢黃素化囊腫、宮腔病變徑線與葡萄胎是否惡變相關(guān)（P＜0.05），孕周、滋養(yǎng)細(xì)胞增生程度、血β-hCG 與葡萄胎惡變無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2 惡變葡萄胎組和良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎組臨床特征比較［n（%）］Table 2 Comparison of clinical features between malignant hydatidiform mole group and benign conversion hydatidiform mole group［n（%）］

2.3 葡萄胎惡變影響因素的多因素Logistic 回歸分析

以葡萄胎是否發(fā)生惡變作為因變量（1=惡變，0=良性轉(zhuǎn)歸），表1和表2中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量作為自變量納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示宮腔病變徑線≥6 cm、Wnt-5a 陽性、Wnt-11陽性及CaMKⅡ蛋白陽性是葡萄胎惡變的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 葡萄胎惡變影響因素的多因素Logistic 回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of hydatidiform mole

2.4 ROC 曲線分析Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ及宮腔病變徑線對葡萄胎惡變的預(yù)測價值

繪制葡萄胎患者首次清宮組織中Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ蛋白及宮腔病變徑線預(yù)測葡萄胎惡變的ROC 曲線。Wnt-11 預(yù)測葡萄胎惡變的的AUC 分別大于宮腔病變徑線（Z=3.481，P=0.000）、CaMKⅡ（Z=2.822，P=0.005）。預(yù)測的AUC與Wnt-5a預(yù)測的AUC 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=1.804，P=0.071）。見圖1、表4。

圖1 Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白預(yù)測葡萄胎惡變的ROC 曲線Figure 1 ROC curves of Wnt-5a，wnt-11 and CaMKⅡproteins in predicting malignant transformation of hydatidiform mole

表4 Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ及宮腔病變徑線預(yù)測葡萄胎惡變的效能比較Table 4 Comparison of the efficacy of Wnt-5a，wnt-11，CaMK Ⅱand uterine cavity lesion diameter in predicting malignant transformation of hydatidiform mole

3 討論

葡萄胎發(fā)生惡變的原因尚不清楚，一般認(rèn)為是同一種疾病的不同發(fā)展階段［9-10］。葡萄胎惡變后具有強(qiáng)大的破壞力，很早便可通過血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，若能早期發(fā)現(xiàn)葡萄胎惡變并給予預(yù)防性化療，其預(yù)后通常更好［11-12］。既往研究［13］顯示，葡萄胎大小與葡萄胎惡變傾向具有密切聯(lián)系，病變越大，發(fā)生惡變的可能也越大。

非經(jīng)典Wnt 信號通路在胚胎早期發(fā)育中體軸的建立、中胚層的模式形成及隨后的器官發(fā)生中起重要作用，該通路異常與眾多器官發(fā)育畸形有關(guān)，此外在多種癌癥中可發(fā)現(xiàn)其不同程度的過表達(dá)［14］。在非經(jīng)典Wnt 信號通路中，Wnt-5a 是最重要的激活因子之一，Wnt-5a 在激活Wnt/Ca2+信號通路，發(fā)揮生物學(xué)功能過程中發(fā)揮重要作用。既往報道指出敲除Wnt-5a 基因的小鼠有嚴(yán)重的四肢缺陷，Wnt-5a 在雌性哺乳類動物的生殖道發(fā)育中發(fā)揮重要作用［15］。Wnt-11 是另外一個重要的Wnt/Ca2+信號通路激活因子，作為非經(jīng)典信號通路的代表性配體，Wnt-11 可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和遷移繼而決定細(xì)胞的命運［16］；另外Wnt-11 能促使細(xì)胞泛素化，導(dǎo)致黏附蛋白的降解及逆轉(zhuǎn)，為細(xì)胞的遷移奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果提示葡萄胎患者首次清宮組織中Wnt-5a、Wnt-11 過表達(dá)可能與葡萄胎惡變相關(guān)。本研究經(jīng)多因素Logistic回歸分析提示W(wǎng)nt-5a、Wnt-11 陽性表達(dá)是的葡萄胎惡變的獨立危險因素，Wnt-5a、Wnt-11 可能是預(yù)測葡萄胎惡變的潛在生物標(biāo)志物。為進(jìn)一步評價首次清宮組織中Wnt-5a、Wnt-11 在預(yù)測葡萄胎惡變中的價值。

在Wnt/Ca2+信號通路中，Wnt 蛋白通過與細(xì)胞膜上相應(yīng)的Frizzled（Fz）家族受體結(jié)合后通過一系列信號傳遞最終引起胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放，使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平瞬間升高，同時細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加可以進(jìn)一步活化CaMKII，活化的CaMKI 繼續(xù)激活其下游通路，來發(fā)揮生物學(xué)功能［17］。本研究結(jié)果表明其對預(yù)測葡萄胎惡變有一定價值。

綜上所述，惡變葡萄胎首次清宮組織中Wnt-5a、Wnt-11 及CaMKⅡ蛋白表達(dá)較良性轉(zhuǎn)歸葡萄胎異常升高，三者對葡萄胎惡變具有較好的預(yù)測價值，在葡萄胎清宮時便可提示其是否有惡變傾向。本研究不足在于納入樣本數(shù)量較小，可能影響結(jié)果的統(tǒng)計效能，更全面、準(zhǔn)確的結(jié)果尚需要進(jìn)行大樣本研究論證。