基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討貓爪草治療肺結(jié)核的作用機制

劉向芳，王 璐，陳 潔，孫 輝，陸紹玉，劉 幸

（昆明市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，昆明 650041）

肺結(jié)核是臨床常見疾病，也是發(fā)病率最高的結(jié)核病，屬于一種慢性傳染性疾病。目前常見的肺結(jié)核治療方法是應(yīng)用抗結(jié)核藥物如異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺，雖然在治療中發(fā)揮良好的藥效，但長期使用這些藥物，毒副作用不可避免，易產(chǎn)生耐藥性，給患者帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)〔1〕。肺結(jié)核在中醫(yī)上屬于“肺癆”范疇〔2〕，尋找新的抗癆藥物是未來研究的熱點。治療肺結(jié)核的機制主要是抑制和殺滅結(jié)核分枝桿菌。

貓爪草為毛莨科植物小毛莨（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥塊根，具有抗菌消炎、消腫解毒、化痰散結(jié)等功效，臨床上常用于治療偏頭痛、牙痛、咽喉腫痛、肺結(jié)核等疾病，現(xiàn)代研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抑菌、保肝、抗氧化等作用，并對耐藥肺結(jié)核患者有較好的療效〔3-5〕，具有較強的細(xì)胞內(nèi)外抗結(jié)核作用，對結(jié)核桿菌具有較強的抑制作用。貓爪草是昆明市第三人民醫(yī)院自擬“抗癆補肺湯”的主要成分，抗癆補肺湯主要通過滋陰補肺、抗菌殺菌，優(yōu)化了血液流變學(xué)，抑制細(xì)菌的繁殖生長，提高了肺部的抗菌能力〔6-7〕。雖然已有部分研究表明，貓爪草具有多系統(tǒng)的藥理作用，但是單味中藥具有較多的活性成分和多靶點的功效，且中藥的活性成分間具有協(xié)同作用的特點，因此，從單一的系統(tǒng)作用去闡述貓爪草的藥理作用，闡述并不全面。

目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興的學(xué)科領(lǐng)域，主要建立在藥理學(xué)的基礎(chǔ)上，基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，可以反映化合物與靶點之間的復(fù)雜相互作用，從而更直觀理解中藥和機體間的相互作用，提高藥物的治療效果，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對貓爪草治療肺結(jié)核機制進行研究，更科學(xué)地闡述貓爪草的現(xiàn)代藥理作用機制，為更有針對性地深入探索貓爪草的藥理作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：∕∕tcmspw.com∕tcmsp.php）；UniProt 數(shù) 據(jù) 庫（http：∕∕www.uniprot.org∕）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.genecards.org）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https：∕∕string-db.org∕）；Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.bioconductor.org∕）；Perl軟件（https：∕∕www.perl.org∕）；R 軟件（https：∕∕www.r-project.org∕）；Cytoscape 3.6.1軟件（http：∕∕www.cytoscape.org∕）。

1.2 貓爪草活性成分篩選及潛在靶點預(yù)測將“貓爪草”輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索框中，限定詞為“Herb name”，搜索貓爪草所含活性成分，依據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)推薦，以口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件。同時通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫的成分靶點預(yù)測模型，獲得貓爪草的靶點，利用Perl軟件在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中提取活性成分對應(yīng)的靶基因，限定物種為“Homo Sapiens”。

1.3 肺結(jié)核靶點篩選通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索肺結(jié)核疾病相關(guān)基因，在搜索框中以“tuberculosis”為關(guān)鍵詞，進行搜索，獲得已經(jīng)報道的肺結(jié)核相關(guān)基因（即疾病靶點），去除假陽性基因，與貓爪草的活性成分靶點進行匹配生成韋恩圖，從而獲得共同靶點。

1.4 貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建根據(jù)貓爪草的活性成分及預(yù)測的靶點，建立“活性成分-作用靶點”的相互對應(yīng)關(guān)系。將活性成分與靶點作為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點（node），制成后綴為txt 的文本文檔，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將共同靶點基因傳至STRING 數(shù)據(jù)庫中，其物種為“Homo Sapiens”，去除離散的點，構(gòu)建貓爪草的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析將交集基因傳至Bioconductor 數(shù)據(jù)庫，運用R 軟件進行基因本體的GO 功能和KEGG 通路富集分析。此過程中，限定物種為“Homo Sapiens”，以P值反應(yīng)生物功能的顯著性及通路的富集程度，P＜0.05 表示該富集結(jié)果具有顯著性；P值越小，其顯著性越高。

2 結(jié)果

2.1 中藥活性成分及對應(yīng)靶點篩選結(jié)果通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索到貓爪草化學(xué)成分79 個，496個靶點。以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18為篩選條件，從而獲得化學(xué)成分12 個，見表1。首先利用Perl 軟件提取12 個化學(xué)成分的對應(yīng)靶點，再在UniProt 數(shù)據(jù)庫中找出化學(xué)成分對應(yīng)的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，去除重復(fù)的基因，共獲得40 個 靶點基因，分別為ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A、ADRB1、ADRB2、AKR1B1、BAX、BCL2、CASP3、CASP8、CASP9、CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM4、CHRNA2、CTRB1、GABRA1、JUN、KCNH2、LTA4H、MAOA、MAOB、MAP2、NCOA1、NCOA2、NR3C2、OPRM1、PGR、PLAU、PON1、PRKCA、PTGS1、PTGS2、RXRA、SCN5A、SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4。

2.2 肺結(jié)核靶點篩選結(jié)果通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫搜索，去除假陽性基因，共獲得2 316 個疾病基因。根據(jù)上述“2.1”所獲得貓爪草活性成分靶點基因40 個和疾病肺結(jié)核靶點基因2 316 個，通過繪制韋恩圖獲得共同靶點基因14 個，分別為ADRB2、PTGS2、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、PLAU、LTA4H、MAOA。見圖1。

表1 貓爪草活性成分篩選結(jié)果

圖1 藥物靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3 貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將貓爪草的活性成分及作用靶點輸入軟件Cytoscape 3.6.1，構(gòu)建“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2。其中三角形圖標(biāo)為活性成分，橢圓形圖標(biāo)為作用靶點，菱形圖標(biāo)為疾病，六邊形圖標(biāo)為藥物。

圖2 貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將“2.2”所獲得的14 個共同靶點基因傳至STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，去除孤立點，該網(wǎng)絡(luò)包括14 個節(jié)點、27 條邊，平均節(jié)點度為3.86，其中節(jié)點間相互關(guān)系評分前20位見表2。

表2 節(jié)點間相互關(guān)系的評分

2.5 GO 功能分析將“2.2”共同靶點基因傳至Bioconductor數(shù)據(jù)庫，運用R軟件對貓爪草靶點進行GO 功能分析，閾值設(shè)置P＜0.05，共得到GO 條目14個，主要包括生物過程、分子功能、細(xì)胞成分，結(jié)果見表3，并將其可視化展示，結(jié)果見圖3。

2.6 KEGG 信號通路分析KEGG 富集分析，閾值設(shè)置P＜0.05，得到20 條信號通路，以P值大小為條件進行篩選，并將其可視化展示，結(jié)果見圖4，前10條信號通路及其涉及的基因見表4。貓爪草治療肺結(jié)核的機制包括細(xì)胞凋亡、p53 信號通路、IL-17 信號通路。其中與肺結(jié)核相關(guān)的通路為細(xì)胞凋亡、p53 信號通路、IL-17 信號通路，對應(yīng)基因為BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8、JUN。

3 討論

貓爪草1977年開始收載于《中華人民共和國藥典》〔8〕，屬于毛茛科植物小毛茛的干燥塊根，該藥為一種非常用草藥，性溫、味甘辛，具有消腫散結(jié)、清熱解毒的功效，現(xiàn)今逐步發(fā)現(xiàn)貓爪草用于治療腫瘤、淋巴結(jié)核和肺結(jié)核等疾病，療效顯著，特別是對耐藥肺結(jié)核患者具有較好療效〔5-7〕。近年來有研究表明貓爪草具有抗腫瘤、抗結(jié)核、免疫調(diào)節(jié)功能、抗氧化等多種活性，是因為貓爪草活性成分中皂苷類具有抗腫瘤作用，甾醇類具有抗結(jié)核、抑菌作用，其抑菌作用較異煙肼稍強，多糖類具有抗氧化、減輕和修復(fù)肝損傷及保肝作用、機體免疫調(diào)節(jié)功能〔6-9〕。

本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫共檢索到貓爪草活性成分12 個，其中有對應(yīng)作用靶點的活性成分為5個。由貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)圖可見，上述5 個活性成分作用于14 個靶點，體現(xiàn)了中藥治療疾病多成分、多靶點的特點。有研究已證實，貓爪草作為一種新的抗結(jié)核藥，不僅能有效地抑制結(jié)核分枝桿菌，還可增強患者的機體免疫力，改善患者肺部血液循環(huán)和病灶周圍的營養(yǎng)，對耐藥菌株有一定療效，并可以抑制持留結(jié)核菌，從而更有效地治療肺結(jié)核〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，貓爪草中的多糖、皂苷成分可使吞噬百分率、吞噬指數(shù)顯著升高，還可顯著促進溶血素的形成并提高外周血中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，可能通過減少結(jié)核分枝桿菌HspX 蛋白表達水平，影響結(jié)核菌的正常代謝發(fā)揮抑菌作用〔11〕。貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點度最高的是β-谷甾醇，其次是豆甾醇，貓爪草的醇提取物可增強耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）感染小鼠的細(xì)胞免疫功能，通過促進GLS mRNA 的表達，增強機體細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）殺菌能力，從而達到抗結(jié)核休眠菌的作用，醇提取物中的吡咯丁酸4-［formyl-5-（hydroxymethyl）-1H-pyrrol-1-yl］butanoicacid 對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37Rv）、耐多藥菌株（MDR）、廣泛耐藥株（XDR）均具有較強的抑制作用〔9〕，而其余三種活性成分與肺結(jié)核相關(guān)性的報道不多，可作為學(xué)者后續(xù)研究的重點之一。貓爪草“活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)中排名前5 位的靶蛋白分別為CASP3、ADRB2、CASP8、CASP9、PTGS2。陳柯宇等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，CASP3 可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長、增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡的分子機制。有研究表明，ADRB2這個基因的變化與支氣管及血管反應(yīng)都有一定的相關(guān)性，可能在某種程度上影響疾病的發(fā)生和發(fā)展過程〔13〕。CASP8 是死亡受體凋亡通路的重要起始型蛋白酶。馬明等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)CASP9 廣泛表達于人類的正常組織，如神經(jīng)組織、肝臟、胃和肺等，且參與線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。PTGS2 能夠促進細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞遷移、黏附及抑制血管生成，在炎癥、各種癌癥的治療中發(fā)揮著很大的作用。鑒于上述靶蛋白在機體炎癥、腫瘤、肺功能等方面產(chǎn)生作用，筆者認(rèn)為其可能成為貓爪草治療肺結(jié)核的相關(guān)靶點。

表3 GO功能分析結(jié)果

圖3 GO功能分析圖

圖4 KEGG信號通路富集分析圖

表4 KEGG信號通路分析結(jié)果

從韋恩圖可知，貓爪草與肺結(jié)核的交集基因共14 個，提示貓爪草對肺結(jié)核的治療具有多靶點協(xié)同作用的特點。PPI 網(wǎng)絡(luò)共包含14 個節(jié)點、27 條邊，平均節(jié)點度為3.86，說明這些交集基因的編碼蛋白之間相互作用緊密。

GO 分析結(jié)果顯示，疾病的靶點主要是針對生物過程，涉及半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、死亡受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等，提示這些生物過程在治療疾病中起到了關(guān)鍵作用。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，貓爪草與肺結(jié)核最相關(guān)的通路包括細(xì)胞凋亡、p53信號通路等。其中細(xì)胞凋亡通路涉及的靶點基因為BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8；p53信號通路涉及的靶點基因為BCL2、BAX、CASP9、CASP3、CASP8。有研究表明，BCL2基因表達可抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖及侵襲，促進其凋亡〔13〕；BAX 抑制傳遞線粒體的抗凋亡信號，在鼠急性腎損傷（AKI）模型中能夠減輕腎衰竭、炎癥和腎小管死亡〔14〕；在順鉑處理后，CASP9 與細(xì)胞凋亡和抗性有關(guān)〔15〕；CASP8 是細(xì)胞凋亡的外在途徑所必需的蛋白酶，在細(xì)胞死亡中起著雙重作用，其中在腫瘤細(xì)胞死亡和耐藥性中起重要作用〔16〕；CASP3 可對肺癌組織較癌旁組織凋亡分子進行調(diào)節(jié)，它可能成為進行藥物干預(yù)的分子標(biāo)志物和靶點〔17〕；JUN 是ATP 刺激的血管生成基因表達的必需因子〔18〕。由上述研究可知，與肺結(jié)核通路相關(guān)的基因包括BCL2、BAX、CASP9、CASP8、JUN、CASP3，它們可能是貓爪草活性成分發(fā)揮治療肺結(jié)核作用的靶點。此外，本研究挖掘出ADH1C、ADRA1A、ADRA1B、ADRA2A等其他靶點基因，也可作為后續(xù)的研究對象。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了貓爪草的活性成分，貓爪草中的豆甾醇、β-谷甾醇等有效化合物可能通過細(xì)胞凋亡、p53信號通路、IL-17 信號通路，作用于BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8等靶點，進而發(fā)揮對肺結(jié)核的治療作用，呈現(xiàn)多成分、多靶點和多通路的特點。除已有報道的活性成分外，還有一些有潛在治療作用的活性成分以及靶點蛋白，可作為后續(xù)研究的重點之一，可為貓爪草治療肺結(jié)核及實驗驗證研究奠定良好的基礎(chǔ)。