地黃RgMATE6轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆、亞細(xì)胞定位與表達分析

楊艷會，楊 恒，張重義，伊艷杰，李瑞芳，董 臣，張宗武，王超杰

地黃轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆、亞細(xì)胞定位與表達分析

楊艷會1，楊 恒1，張重義2，伊艷杰1，李瑞芳1，董 臣1，張宗武1，王超杰1

1. 河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001 2. 福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

克隆地黃多藥及有毒化合物外排（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）轉(zhuǎn)運蛋白基因，并進行亞細(xì)胞定位與時空表達分析，為深入研究其在地黃轉(zhuǎn)運次生代謝產(chǎn)物中的分子功能奠定基礎(chǔ)。利用地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫候選基因序列，利用實時熒光PCR（RT-PCR）克隆基因；利用生物信息學(xué)軟件對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、同源性和進化樹進行分析；通過與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達進行亞細(xì)胞定位；利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的方法測定該基因的時空表達模式。克隆獲得1892 bp的基因序列，基因編碼524個氨基酸、具有2個典型的MatE結(jié)構(gòu)域和12個跨膜結(jié)構(gòu)；RgMATE6蛋白與越橘的VcMATE6蛋白親緣關(guān)系最近；RgMATE6-GFP載體瞬時表達的結(jié)果發(fā)現(xiàn)RgMATE6蛋白定位在液泡膜上；qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)基因在地黃不同時期的根中表達最高，尤其是塊根膨大前期。RgMATE6蛋白定位在液泡膜上，在地黃塊根膨大期的根中表達較高，初步表明RgMATE6可能參與地黃體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物向液泡轉(zhuǎn)運的過程。

地黃；MATE轉(zhuǎn)運蛋白；生物信息學(xué)；亞細(xì)胞定位；表達分析

地黃Libosch為玄參科地黃屬多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的四大懷藥之一。地黃體內(nèi)的許多次生代謝產(chǎn)物均具有生物活性，常見的有毛蕊花糖苷、梓醇及多糖類，具有抗炎、抗腫瘤、緩瀉等作用，在臨床上廣泛應(yīng)用[1]。目前大量的研究主要集中在地黃體內(nèi)活性物質(zhì)的鑒定及其藥理機制上，且對毛蕊花糖苷[2]、梓醇[3]等主要活性物質(zhì)的生物合成途徑也已有相關(guān)研究。然而，地黃次生代謝通路下游次生代謝產(chǎn)物從合成部位到貯存部位的跨膜轉(zhuǎn)運研究尚不清楚。

液泡是植物積累次生代謝產(chǎn)物的主要場所之一，而次生代謝產(chǎn)物從合成部位轉(zhuǎn)運到液泡中儲存的過程，要通過位于液泡膜上的轉(zhuǎn)運蛋白的介導(dǎo)來完成[4]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了一類重要的次生代謝轉(zhuǎn)運通道，即多藥及有毒化合物外排（multidrug and toxic compound extrusions，MATEs）轉(zhuǎn)運蛋白家族。這類蛋白在植物體內(nèi)廣泛存在，能將自身次生代謝的產(chǎn)物運輸?shù)揭号輧?nèi)并進行貯存，從而保持這些次生代謝產(chǎn)物本身的生物活性[5]。植物MATEs均為膜蛋白，具有9～12個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（transmembrane helices，TMs），由400～550個氨基酸殘基組成[6]，典型MATEs蛋白的二級結(jié)構(gòu)的高度保守序列均位于TM1和TM7附近，MATEs蛋白的N端（TM1～TM6）和C端（TM7～TM12）之間形成1個向液泡內(nèi)開放的“V”字形空腔，并依賴質(zhì)子或者陽離子濃度勢能差，通過其空間構(gòu)象的改變，執(zhí)行著特異底物轉(zhuǎn)運的功能[7]。前人在許多植物的研究中已明確地鑒定了轉(zhuǎn)運黃酮類、萜類、酚類等次生代謝產(chǎn)物的MATEs基因及其蛋白。擬南芥MATEs家族成員AtDTX1[8]、AtTT12[9]和AtFRD3[10]能把酚酸、黃酮等次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)；蒺藜苜蓿MtMATE1和MtMATE2能把黃酮苷、糖苷類和丙二酸苷轉(zhuǎn)運到液泡中[11]；葡萄的2個MATEs成員VvAM1和VvAM3參與了花色素苷的轉(zhuǎn)運與積累[12]；草莓FaTT12-1（MATEs家族成員）具有轉(zhuǎn)運酚類物質(zhì)的功能[13]。可見，MATEs在植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。

在次生代謝過程中，地黃體內(nèi)產(chǎn)生了許多重要的活性物質(zhì)，并在其細(xì)胞內(nèi)大量積累。植物MATEs在次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運與積累過程中發(fā)揮著重要作用，推測地黃體內(nèi)也可能存在著轉(zhuǎn)運次生代謝產(chǎn)物的MATEs蛋白，而地黃MATEs基因及蛋白一直未被鑒定與研究。由于地黃的基因組數(shù)據(jù)匱乏，本研究利用地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫候選1條MATE基因序列（命名為），利用RT-PCR方法克隆基因，利用在線軟件對該基因編碼的蛋白序列進行分析；利用同源重組、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）等技術(shù)進行亞細(xì)胞定位和表達模式分析，以期初步揭示RgMATE6蛋白在地黃次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運中的功能。

1 材料與儀器

1.1 材料

本研究所用實驗材料為地黃品種“溫85-5”，由河南工業(yè)大學(xué)楊艷會副教授鑒定為地黃Libosch，種植于河南工業(yè)大學(xué)中藥材生態(tài)觀測站（溫縣基地），在苗期、拉線期、塊根膨大前期、塊根膨大中期、塊根膨大后期和成熟期共6個不同生長時期[14]，分別收集地黃根、莖和葉的新鮮樣品，放入液氮速凍后，?80 ℃保存，用于基因的克隆及qRT-PCR。

總RNA提取Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；pBI121-GFP瞬時表達載體購自BioVector公司；質(zhì)粒提取試劑盒和卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司，Super-Fidelity DNA Polymerase高保真酶、HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收試劑盒、DL 2000 DNA Marker、限制性核酸內(nèi)切酶I、無縫克?。↖n-fusion HD cloning kit）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)、克隆載體pMD18購自大連寶生物（Takara）公司，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 儀器

Axio Vert A1型熒光顯微鏡，德國蔡司公司；FV 3000型激光共聚焦掃描顯微鏡，日本奧林巴斯公司；StepOne Real-Time PCR System型熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

2 方法

2.1 RNA的提取與cDNA的獲得

將地黃不同時期的根、莖、葉3種組織樣品分別在液氮中充分研磨成粉末，使用Trizol總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA，利用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。取1 μg的總RNA，使用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于?20 ℃下貯存。

2.2 RgMATE6基因的克隆

基于地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得的1個基因的Unigene片段，NCBI BlastN比對發(fā)現(xiàn)該序列是全長序列，利用Oligo 7.0軟件分別從5’和3’末端設(shè)計基因的特異引物（表1）。以所有樣品的混合cDNA為模板進行PCR擴增，程序為94 ℃、3 min；98 ℃、15 s，61 ℃、30 s，72 ℃、2 min，36個循環(huán)；72 ℃、7 min，然后通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。利用膠回收試劑盒回收目的片段，并將其連接到Takara公司的pMD18克隆載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)。經(jīng)抗性篩選后進行菌液PCR檢測，將含有與目的片段大小一致的條帶的菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

表1 克隆及qRT-PCR引物

2.3 生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder工具預(yù)測基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF），利用ProtParam工具分析其蛋白的理化性質(zhì)；利用TMHMM軟件預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SMART軟件分析功能結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA和SWISS-MODEL工具分別預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；通過DNAMAN 5.0軟件對RgMATE6與其他物種的MATEs蛋白的氨基酸序列進行同源性分析；使用MEGA 7.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建MATEs蛋白家族進化樹。

2.4 RgMATE6的亞細(xì)胞定位

為構(gòu)建5’端加GFP標(biāo)簽的融合蛋白表達載體，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計基因的特異引物（表1）并進行克隆，用Takara公司的無縫克隆試劑盒構(gòu)建35S : RgMATE6-GFP表達載體。用CaCl2法制備GV3101農(nóng)桿菌化學(xué)感受態(tài)，并通過凍融法將35S : RgMATE6-GFP和35S : GFP（對照）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法將2種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，25 ℃避光培養(yǎng)48 h，在激發(fā)光為470 nm的條件下用熒光顯微鏡觀察GFP信號；參考制備擬南芥原生質(zhì)體的酶解法制備地黃原生質(zhì)體[15]，通過PEG-4000介導(dǎo)的方法將35S : RgMATE6-GFP和35S : GFP（對照）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入地黃原生質(zhì)體，25 ℃避光培養(yǎng)20 h，在激發(fā)光為470 nm的條件下用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察GFP信號。

2.5 qRT-PCR分析

使用Beacon Designer 8.0軟件設(shè)計基因和內(nèi)參基因（GenBank注冊號EU526396）的qRT-PCR引物（表1）。以cDNA為模板，參照熒光定量試劑盒說明書配制體系，采用標(biāo)準(zhǔn)程序進行擴增。采用2?ΔΔCt方法計算基因的相對表達量，每個樣本進行3次生物學(xué)重復(fù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 RgMATE6基因的克隆

用瓊脂糖凝膠電泳檢測各樣品的總RNA，由圖1-A可看出，28 S和18 S的條帶清晰沒有拖尾的現(xiàn)象，同時28 S比18 S的條帶更亮，5 S的條帶較暗，可用于下游實驗。圖1-B是基因的陽性克隆菌液PCR產(chǎn)物的檢測結(jié)果，其長度約1900 bp，其測序后的序列與目的基因序列（1892 bp）一致，表明基因克隆成功。

3.2 RgMATE6蛋白的序列特征

3.2.1 RgMATE6蛋白的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)分析ORF Finder預(yù)測基因的ORF為1575 bp，編碼524個氨基酸。ProtParam分析得到RgMATE6蛋白的相對分子質(zhì)量為57 279.25，理論等電點為5.29，分子式為C2682H4100N632O709S23；該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為31.2，是穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為112.46，總平均親水性為0.693，屬于疏水性蛋白。SOPMA工具分析結(jié)果如圖2-A所示，圖2-B是SWISS-MODEL軟件建立的RgMATE6蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。RgMATE6蛋白的二級結(jié)構(gòu)包含292個α螺旋（55.73%），106個無規(guī)則卷曲（20.23%）及126個折疊形態(tài)延伸鏈（20.05%），α螺旋是主要組成部分。TMHMM預(yù)測的跨膜結(jié)構(gòu)域如圖3-A所示，該蛋白有12個跨膜螺旋，符合MATEs轉(zhuǎn)運蛋白家族的12個典型跨膜螺旋的結(jié)構(gòu)特征。如圖3-B所示，SMART軟件分析發(fā)現(xiàn)該蛋白具有2個MATEs轉(zhuǎn)運蛋白家族特有的MatE結(jié)構(gòu)域，可確定基因是MATEs轉(zhuǎn)運蛋白家族成員。

1～3-RNA M-Marker 4，6～7-RgMATE6全長片段連接 pGM-T質(zhì)粒的菌液PCR 5-未檢出

α-α-螺旋 β-β-折疊 R-隨機卷曲 E-延伸鏈

圖3 RgMATE6蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(A) 和保守結(jié)構(gòu)域分析(B)

3.2.2 RgMATE6蛋白的同源性及系統(tǒng)進化樹分析 對RgMATE6蛋白序列與其他植物中MATEs的蛋白序列進行多重比對，由圖4可看出，地黃RgMATE6蛋白與越橘L. VcMATE6（登錄號KF875437）、芝麻L. SiDTX30（登錄號XP_011086621.1）、寄生草L. SaMATE（登錄號GER37032.1）、煙草L. NtDTX29（登錄號XP_016515174.1）蛋白具有較高的同源性（約80%）。為明確地黃RgMATE6在植物MATEs家族中的進化位置，選取RgMATE6與其他植物功能己知的MATEs序列構(gòu)建MATEs家族進化樹，由圖5可看出，RgMATE6與越橘VcMATE6、擬南芥AtFFT/DTX35、苜蓿MtMATE2和煙草的NtJAT2聚為一類，且與VcMATE6的親緣關(guān)系最近。

3.3 RgMATE6蛋白的亞細(xì)胞定位

將含有35 S : RgMATE6-GFP和35 S : GFP載體的農(nóng)桿菌侵染洋蔥表皮細(xì)胞后觀察。如圖6所示，在熒光顯微鏡下觀察到35 S : GFP載體在洋蔥細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、液泡膜等部位均顯示綠色熒光信號；而在35 S : RgMATE6-GFP表達的洋蔥表皮細(xì)胞中，僅在液泡膜上檢測到綠色熒光信號，初步表明RgMATE6蛋白定位在液泡膜上。

為進一步驗證RgMATE6的亞細(xì)胞定位結(jié)果，將35 S : RgMATE6-GFP和35 S : GFP載體轉(zhuǎn)化到地黃原生質(zhì)體中進行瞬時表達。由圖7可看出，在激光共聚焦掃描顯微鏡下，35 S : GFP載體的綠色熒光信號在原生質(zhì)體各個部位均能檢測到，無特異的熒光信號；而35 S : RgMATE6-GFP表達的原生質(zhì)體僅在液泡膜上發(fā)出特異的熒光信號。以上結(jié)果表明：RgMATE6蛋白定位在液泡膜上。

3.4 RgMATE6基因的表達模式分析

為進一步分析基因的表達模式，利用qRT-PCR技術(shù)對基因在不同時期不同組織中的相對表達量進行檢測。基因在地黃根、莖、葉中均有表達，但其表達量存在著明顯的差異。在各組織中，除苗期以外，基因在根中均具有較高表達量，其次是莖，而葉中的表達量最低；在不同的發(fā)育時期中，基因在各組織中的表達量均呈先升后降的趨勢，該基因在塊根膨大前期的各組織中具有較高的表達量，其次是塊根膨大中期，在苗期和成熟期時各組織的表達量較低。

黑線顯示RgMATE6的跨膜結(jié)構(gòu)域

圖5 RgMATE6與植物MATE家族部分蛋白的進化樹分析

A-RgMATE6-GFP載體 B-GFP載體

A-RgMATE6-GFP載體 B-GFP載體

4 討論

在植物次生代謝途徑中，為避免一些次生代謝產(chǎn)物被分解而失去生物活性，需要通過轉(zhuǎn)運通道系統(tǒng)將次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到液泡中進行屏蔽和貯存，而植物MATEs蛋白在這些活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運與積累的過程中發(fā)揮重要的作用[16]。地黃體內(nèi)重要的活性成分均是次生代謝產(chǎn)物，而目前關(guān)于地黃體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運通道的研究鮮有報道。基于此，本研究通過地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和在線軟件鑒定了1個MATE基因，其編碼了524個氨基酸，其蛋白具有2個MATEs轉(zhuǎn)運蛋白家族特有的MatE結(jié)構(gòu)域和12個跨膜螺旋的基本特征。這些信息初步表明具有潛在的植物MATEs家族轉(zhuǎn)運蛋白的特征。

通過RgMATE6蛋白與其他植物中功能已知的MATEs蛋白進行氨基酸序列的多重比對與進化樹分析，發(fā)現(xiàn)地黃RgMATE6蛋白與越橘、擬南芥、苜蓿和煙草中的MATEs家族成員具有較近的進化關(guān)系。研究表明，越橘VcMATE6可能參與了次生代謝產(chǎn)物中類黃酮的轉(zhuǎn)運及其液泡積累的過程[17]。在花器官發(fā)育過程中，擬南芥的AtFFT/DTX35是運輸黃酮的1個重要通道蛋白[18]。煙草NtJAT在轉(zhuǎn)運次生代謝物（煙堿）的過程中起重要調(diào)控作用[19]。由此推測，RgMATE6也可能參與了地黃體內(nèi)一些次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運過程。植物MATEs轉(zhuǎn)運蛋白能將由次生代謝產(chǎn)生的生物堿、糖苷類、萜類化合物、酚類等多種活性物質(zhì)運輸?shù)揭号輧?nèi)并大量積累，從而實現(xiàn)自身細(xì)胞內(nèi)源性物質(zhì)的解毒功能，有助于進一步調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多種活性物質(zhì)的分布、積累和平衡，以維持植物正常的生長發(fā)育過程[20]。研究表明，擬南芥AtFFT/DTX35、苜蓿MtMATE2、煙草NtJAT2和越橘VcMATE6均定位在液泡膜上，這些MATEs蛋白均參與了植物體內(nèi)酚類、糖苷類、生物堿等重要活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運與積累過程。RgMATE6與這些MATEs家族成員存在著較近的親緣關(guān)系，此外，本研究的實驗結(jié)果也證明了RgMATE6蛋白定位在液泡膜上。由此推測，基因可能參與了地黃體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物向液泡轉(zhuǎn)運與積累的過程。

此外，植物中大多數(shù)的MATEs基因存在著明確的時空表達模式。和基因僅在根中表達，而煙草基因在葉、莖和根均表達[21]。擬南芥MATEs家族成員基因幾乎在所有組織均有表達。在本研究中，基因在各組織均有表達，但其不同組織的表達量存在著差異，基因在根中的表達最為強烈；而且塊根膨大期是地黃生長的關(guān)鍵期，在塊根膨大前期和中期的根中表達水平較高。地黃塊根是臨床藥用部位，貯存著大量的活性物質(zhì)，基因在地黃塊根中的強烈表達，表明該基因可能在地黃體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物向液泡內(nèi)部轉(zhuǎn)運與積累的過程中執(zhí)行著重要的分子功能。

綜上所述，本研究鑒定的RgMATE6蛋白可能是地黃體內(nèi)轉(zhuǎn)運一些次生代謝產(chǎn)物的重要通道蛋白。雖然基因的分子功能仍需進一步驗證，但本研究可為深入闡明其在地黃體內(nèi)次生代謝過程中活性物質(zhì)轉(zhuǎn)運與積累的分子機制提供重要的理論依據(jù)，且對深入揭示地黃體內(nèi)藥效成分積累的分子調(diào)控機制具有重要參考價值。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Clone, subcellular localization and expression analysis oftransporter protein gene from

YANG Yan-hui1, YANG Heng1, ZHANG Zhong-yi2, YI Yan-jie1, LI Rui-fang1, DONG Chen1, ZHANG Zong-wu1, WANG Chao-jie1

1. College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China 2. College of Crop Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

To clone a multidrug and toxic compound extrusion gene () in, determine its subcellular localization and analyze its spatio-temporal expression pattern for further exploring its molecular function of secondary metabolite transports.gene, which was obtained fromtranscriptome data, was cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. The structures, physicochemical properties, homology and phylogeny of RgMATE6 protein were analyzed by bioinformatic software. RgMATE6 was localized via the fusion expression system of its green fluorescence protein (GFP). The expression pattern ofgene was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) technology.The clonedgene sequence was 1892 bp in length. It encoded 524 amino acids, and its protein had two typical MatE domains and 12 transmembrane structures. Homologous and phylogenetic analysis revealed that RgMATE6 had a closed homology with VcMATE6 from. The transient expression of RgMATE6-GFP vector found that RgMATE6 localized in vacuolar membrane. The qRT-PCR analysis showed that the expression levels ofgene were higher in roots than in other tissues at various stages (especially tuberous expansion earlier stage).The RgMATE6 protein localized in vacuolar membrane, and the gene expression was higher inroots relative to stems and leaves at tuberous expansion earlier stages. The results preliminarily suggested that RgMATE6 may involve in the vacuolar transport process of secondary metabolite in.

Libosch; MATE transporter protein; bioinformatics; subcellular localization; expression analysis

R286.12

A

0253 - 2670(2021)06 - 1728 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.022

2020-07-06

國家自然科學(xué)基金資助項目（81973417）；河南省重點研發(fā)與推廣專項（182102310606）；國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFC1700705）；河南工業(yè)大學(xué)科學(xué)研究基金項目（2017RCJH05）

楊艷會（1974—），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向為藥用植物分子生物學(xué)。Tel: (0371)67756928 E-mail: yyhui2004@126.com

[責(zé)任編輯 時圣明]