基于orthogonal design優(yōu)選墓頭回中總多糖含量測(cè)定條件*

王嘉琛，張莉丹，王伊楠，郭宇航，董征艷，姚隆丹，段秀俊

(1 山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031;2 山西中醫(yī)藥大學(xué)， 山西 太原 030031)

墓頭回始載于李時(shí)珍的《本草綱目》，是敗醬科敗醬屬植物糙葉敗醬PatriniascabraBunge和異葉敗醬PatriniaheterophyllaBunge的根莖或全草，性涼，味苦、微酸澀，具有燥濕止帶、收斂止血、清熱解毒的功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)墓頭回中含有豐富的多糖類活性成分，并具有提高機(jī)體免疫力、抗菌、抗病毒、抗癌等[2-6]多種作用。近年來對(duì)墓頭回中有效成分分離與提純等方面都取得了較大進(jìn)展，但是對(duì)墓頭回中總多糖含量的測(cè)定較為少見，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)墓頭回中多糖的顯色條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)不同產(chǎn)地墓頭回中總多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與儀器

UV-610S紫外-可見分光光度計(jì)，上海元析儀器責(zé)任有限公司；KQ5200V超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；7D5A-WS離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；UW120D十萬分之一電子天平，島津；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

墓頭回藥材10批，均購自安徽亳州，為敗醬科敗醬屬植物糙葉敗醬，產(chǎn)品信息情況見表4由山西中醫(yī)藥大學(xué)段秀俊副教授鑒定為正品；濃硫酸；苯酚(批號(hào)：20150506)，購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110833-201205)，購于中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇(批號(hào)：20190408)，購于天津市北辰方正試劑廠。

2 方法與結(jié)果[7-8]

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的D-無水葡萄糖對(duì)照品10.25 mg，加水溶解并定容至50 mL，做為對(duì)照品母液(濃度0.205 mg/mL)。精密吸取對(duì)照品母液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，制成濃度為0.0513 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

取墓頭回粉末(過五號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置50 mL圓底瓶中，加水5 mL，100 ℃回流60 min，放至室溫，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，加無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，搖勻，置4 ℃冰箱靜置12 h，離心(轉(zhuǎn)速設(shè)定3500 r/min，10 min，下同)，取沉淀加65%乙醇5 mL洗滌1次，離心，取沉淀物加水使溶解，定容到100 mL容量瓶中，即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2.0 mL，各加入具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴冷卻5 min，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，分別用全波長(zhǎng)掃描二者的紫外吸收?qǐng)D譜，顯示二者在489 nm處均有最大吸光度，故選489 nm為最大吸收波長(zhǎng)。

2.3 墓頭回中總多糖含量測(cè)定顯色條件的優(yōu)化[9]

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)考察

2.3.1.1 苯酚濃度對(duì)墓頭回中總多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管分別中加入濃度為5%、6%、7%、8%、9%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冰水浴冷卻5 min后，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度，以苯酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖1。

圖1 苯酚濃度對(duì)于吸光度的影響

2.3.1.2 顯色反應(yīng)溫度對(duì)墓頭回中總多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冰水浴冷卻5 min后，分別置于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度，以顯色溫度為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖2。

圖2 顯色溫度對(duì)于吸光度的影響

2.3.1.3 顯色時(shí)間對(duì)墓頭回中總多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴冷卻5 min，置沸水浴中分別加熱5、10、15、20、25 min，再置冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度以顯色時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖3。

圖3 顯色時(shí)間對(duì)于吸光度的影響

2.3.1.4 靜置時(shí)間對(duì)墓頭回中總多糖含量測(cè)定結(jié)果的影響

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下溶液2.0 mL供試品溶液5份，于具塞試管中加入7%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴中分別冷卻0.5、5.5、10.5、15.5、20.5 min，置沸水浴中加熱15 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度以靜置時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖4。

圖4 靜置時(shí)間對(duì)于吸光度的影響

2.3.1.5 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過對(duì)苯酚濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度、靜置時(shí)間四個(gè)單因素對(duì)墓頭回中多糖顯色結(jié)果的考察，發(fā)現(xiàn)苯酚濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度對(duì)顯色結(jié)果影響較大，而靜置時(shí)間對(duì)結(jié)果影響并不明顯，故選擇苯酚濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度這個(gè)三個(gè)因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察。

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選顯色條件

以墓頭回中總多糖的含量測(cè)定結(jié)果為考察指標(biāo)，選擇對(duì)顯色條件影響較大的三個(gè)顯色時(shí)間、顯色溫度、苯酚濃度做為考察因素，每因素設(shè)定三個(gè)水平，采用L9(34)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素與水平安排見表1，分別按表2中的九組條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

由表2可見，最高分的組合為正交4實(shí)驗(yàn)，由此得出的最佳工藝組合為A2B1D3。由表3的正交實(shí)驗(yàn)方差分析表可知，影響吸光度順序?yàn)椋篈(顯色時(shí)間)>B(顯色溫度)>D(苯酚濃度)，且A對(duì)總多糖的顯色條件有顯著性影響(P<0.05)，B、C沒有顯著性影響(P>0.05)，得出的最佳組合為A2B1D3。因此綜合分析，最佳的實(shí)驗(yàn)條件，即苯酚濃度為9%，水浴溫度為70 ℃，加熱時(shí)間為10 min。

2.4 方法學(xué)考察[8]

2.4.1 墓頭回總多糖的測(cè)定法

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，精密吸取供試品溶液或?qū)φ掌啡芤?.0 mL，于具塞試管中加入9%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置于70 ℃水浴中加熱10 min，再置于冰水浴中冷卻5 min，以隨行試劑作空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度。

2.4.2 線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置具塞試管中，蒸餾水補(bǔ)充體積至2.0 mL，加入9%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，置70 ℃水浴中，加熱顯色10分鐘后立即取出，置冰水浴冷卻5 min；精密吸取蒸餾水2 mL同上述操作，作為空白對(duì)照，于489 nm測(cè)定吸光度。以濃度(x)為橫坐標(biāo)，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=13.76x+0.0349，R2=0.9997。結(jié)果表明，無水葡萄糖溶液在0.00257-0.0513 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下D-葡萄糖對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次吸光度，得RSD為1.13%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取1份供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法每隔10 min，測(cè)定吸光度并計(jì)算RSD值，RSD為2.1%，表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性考察

取6份供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD值為2.49%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知總多糖含量的墓頭回多糖粗粉6份，每份約為0.05 g，按樣品中含量加入適量D-葡萄糖對(duì)照品，依法測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4，得加樣回收率均值為99.75%，RSD為2.02%，RSD<3%，表明本法準(zhǔn)確性好。

表4 加樣回收率考察結(jié)果

2.4.7 不同產(chǎn)地批次的墓頭回含量測(cè)定

精密稱取不同產(chǎn)地批次的墓頭回藥材粉末10份，按“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法顯色并重復(fù)測(cè)定總多糖含量。結(jié)果見表5。

表5 不同產(chǎn)地批次的墓頭回含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

現(xiàn)代研究表明，墓頭回具有抑菌、抗癌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫的功效[9-11]。無論是對(duì)于小鼠移植性肝癌腫瘤的抑制[12]亦或?qū)τ隗w外肺源腺癌細(xì)胞SPCA-1、人肝癌細(xì)胞系HepG2、和人慢性髓系白血病細(xì)胞K562的殺滅[13]，均有良好的作用。但研究多集中于多糖的作用，對(duì)于不同產(chǎn)地的墓頭回中多糖的含量及最優(yōu)的顯色條件并無文獻(xiàn)報(bào)道，故本文對(duì)此進(jìn)行研究。

本文選取了苯酚濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度、靜置時(shí)間四個(gè)單一因素對(duì)墓頭回多糖的顯色結(jié)果進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)苯酚濃度、顯色時(shí)間、顯色溫度對(duì)顯色結(jié)果影響較大。隨后進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選了最佳實(shí)驗(yàn)條件。并進(jìn)行了嚴(yán)密的方法學(xué)考察，證明此方法嚴(yán)謹(jǐn)可行，為墓頭回多糖的測(cè)定提供了一種有效可行的方法。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地與批次的墓頭回中多糖進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的墓頭回中多糖含量有較大差異，但并未對(duì)其余成分進(jìn)行測(cè)定。后續(xù)考慮采用HPLC指紋圖譜對(duì)墓頭回中其余黃酮及各類成分進(jìn)行全面定性與定量分析，以期對(duì)墓頭回的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。