連接酶鏈反應(yīng)（LCR）在CT感染中的應(yīng)用

操良會(huì)

（重慶市長(zhǎng)壽區(qū)中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 401220）

0 引言

沙眼衣原體（CT）感染為常見的性傳播疾病。我國(guó)的CT感染率較高，特別是高危人群的感染率達(dá)5%-17%[1]。目前，CT檢測(cè)采用直接鏡檢、細(xì)胞培養(yǎng)、直接熒光抗體染色等方法[2]，其中細(xì)胞培養(yǎng)是“金標(biāo)準(zhǔn)”。連接酶鏈反應(yīng)（LCR）是類似于PCR，通過耐熱DNA連接酶將2對(duì)引物連接到靶核苷酸序列上，并在體外進(jìn)行變性、復(fù)性完成核酸擴(kuò)增[3]。本文探討LCR在CT檢測(cè)中的應(yīng)用，為臨床提供快速高效的實(shí)驗(yàn)診斷。

1 資料與方法

1.1 一般資料。實(shí)驗(yàn)組：2017年1至10月我院收治的160例CT感染者，男77例，女83例，年齡15～73歲；對(duì)照組：同期進(jìn)行體檢的30例健康人，男21例，女9例，年齡1～72歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：至少一種泌尿生殖道感染癥狀（如：分泌物增多、排尿困難、外陰紅腫瘙癢）；有非婚性接觸史，或2周內(nèi)有過與上述癥狀者性交，且未接受過抗生素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：無非婚性行為，生殖道不適，外陰紅腫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)。Hella229細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫）與含10%FBS（SH30396.03，HyClone）的1640（SH30809.01，HyClone）培養(yǎng)液混合調(diào)整密度為1×105/mL，取0.5 mL混合液加入24孔板中放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，吸出培養(yǎng)液，向培養(yǎng)液中加入0.2 mL待檢者生殖器拭取物標(biāo)本，3000 rpm離心1 h，取上清液后加入混合試劑（放線菌酮1μg/mL、慶大霉素10μg/mL、萬古霉素10μg/mL、兩性霉素B2.5μg/mL及衣原體培養(yǎng)液1 mL），將樣本與標(biāo)準(zhǔn)陽性標(biāo)本進(jìn)行比較。

1.3 連接酶鏈反應(yīng)（LCR）。采集晨尿或長(zhǎng)時(shí)間不排尿后的首次尿20-30 mL。檢測(cè)前混合尿液，取1 mL加入到微型離心管中離心（13000 rpm，10 min），棄上清液，加入1 mL裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）。取100μL裂解物置入擴(kuò)增管，按CT試劑盒配置反應(yīng)體系（美國(guó)Abbot公司），放入LCR擴(kuò)增儀（Abbott LCx Thermal Cycler）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：變性96℃，35 s；退火54℃，30 s；延伸60℃，35 s，40次循環(huán)。

1.4 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。靈敏度=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)＋假陰性數(shù)）、特異度=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)＋假陽性數(shù)）、陽性預(yù)測(cè)值=真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)＋假陽性數(shù)）、陰性預(yù)測(cè)值=真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)＋假陰性數(shù)）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率（n，%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＞0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。kappa檢驗(yàn)進(jìn)行一致性分析，kappa＞0.7有高度一致性。

2 結(jié)果

2.1 LCR檢測(cè)對(duì)CT感染的診斷價(jià)值。160例CT感染者的尿標(biāo)本分別進(jìn)行LCR和細(xì)胞培養(yǎng)，LCR檢出85例，細(xì)胞培養(yǎng)確診70例（表1，圖1），兩種方法檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且LCR和細(xì)胞培養(yǎng)的檢出率分別為53.1%和77.7%。LCR檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為100.00%、83.33%、82.37%、100.00%。

表1 LCR與細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果

2.2 LCR與細(xì)胞培養(yǎng)的一致性分析。LCR診斷CT的ROC曲線下面積為0.912（95%CI:0.862-0.961，圖1），Kappa值為0.814，表明LCR法檢測(cè)CT的診斷價(jià)值較高，與細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果有較高一致性（P＜0.0001）。

圖1 LCR診斷CT的ROC曲線

2.3 健康人群LCR和細(xì)胞培養(yǎng)的CT檢出率比較。30例健康人群的尿標(biāo)本分別進(jìn)行LCR檢測(cè)和細(xì)胞培養(yǎng)（表2，圖2），LCR檢出3例，細(xì)胞培養(yǎng)未檢出。兩種方法的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.236）。

表2 健康人群LCR與細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)

3 討論

圖2 健康人群CT的檢出率

CT為泌尿生殖道感染的重要病原體之一，受感染者數(shù)量呈持續(xù)增長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)作為臨床診斷CT最直接的依據(jù)，表現(xiàn)出較多缺點(diǎn)：①耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，技術(shù)要求高，成本高，不利于臨床大量標(biāo)本的檢測(cè)；②檢測(cè)的是活體CT，標(biāo)本采集、運(yùn)送、接種等過程可能存在病原體丟失、活力減弱或失活，造成敏感性降低；③標(biāo)本采集有侵入性，可能存在二次感染。

鑒于此，我們引入LCR技術(shù)，其敏感性和特異性均優(yōu)于聚合酶鏈反應(yīng)[5]，診斷CT的價(jià)值較大[6-8]。本次數(shù)據(jù)表明，160例CT感染者進(jìn)行LCR檢測(cè)，陽性率達(dá)53.1%，漏檢率為0（敏感度100%），彌補(bǔ)了細(xì)胞培養(yǎng)敏感性低的缺點(diǎn)。當(dāng)患者進(jìn)行LCR檢測(cè)CT為陰性時(shí)，基本可以排除CT感染（陰性預(yù)測(cè)值為100%），而CT為陽性時(shí)，應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀及病史判斷患者是否存在CT感染（陽性預(yù)測(cè)為82.37%）。數(shù)據(jù)還表明LCR診斷CT的準(zhǔn)確率及臨床價(jià)值較高，可使用LCR對(duì)CT初篩。而30例健康人群LCR檢測(cè)3例CT陽性，分析產(chǎn)生的誤差可能是實(shí)驗(yàn)過程中受污染，需優(yōu)化LCR實(shí)驗(yàn)流程[9-12]。

綜上所述，LCR檢測(cè)在一定程度上可替代CT的培養(yǎng)，對(duì)CT感染的診斷具有指導(dǎo)作用，可為CT感染的治療提供參考依據(jù)。