玉米苞葉黃酮的提取純化及其抗氧化性能研究

芮懷瑾，劉 郁，白 云，燕傳勇，張 鋒，周 穎，聶錦濤

（1. 徐州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院化學工程學院，江蘇徐州 221140；2. 南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095）

玉米苞葉是植物玉米的外苞葉，不僅是玉米植株進行光合作用、貯藏光合產(chǎn)物的器官，而且為雌穗的生長提供優(yōu)質(zhì)的生存條件[1]。我國是世界范圍內(nèi)玉米種植生產(chǎn)大國，2019 年我國玉米產(chǎn)量高達26 077 萬t，玉米苞葉資源豐富，據(jù)統(tǒng)計每公頃玉米可采收玉米苞葉600 kg 左右。有研究發(fā)現(xiàn)，玉米苞葉中富含生物活性物質(zhì)，如黃酮、花青素、花色苷、多糖等，具有清除自由基、調(diào)節(jié)血脂、預防動脈粥樣硬化、降血糖、抑制α - 糖苷酶等藥理作用，具有較好的醫(yī)療保健作用[2-5]。然而，一直以來玉米苞葉在我國多被用來燃燒或作為飼料使用，造成嚴重的資源浪費和環(huán)境污染。張沐新等人[6]對玉米苞葉黃酮進行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，玉米苞葉中黃酮物質(zhì)類型豐富，具有較高的深入研究價值。吳春等人[7]研究發(fā)現(xiàn)，2 mg/mL 的玉米苞葉黃酮純化物溶液對大腸桿菌有顯著的抑菌作用，但對霉菌的抑制作用較弱。同時，其他植物來源的黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用均已得到研究證明。陳冰等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，桑葉黃酮對吉富羅非魚肌肉具有較好的抗氧化能力，并能改善肌肉氨基酸成分。芮懷瑾等人[9]研究證明，玉米須黃酮作為安全有效的天然抗氧化物質(zhì)，能較好地抑制冷藏豬肉糜的脂質(zhì)氧化，維持肉糜品質(zhì)。

目前，對玉米苞葉中活性物質(zhì)的研究較少，主要集中在低聚糖和多糖上，對玉米苞葉黃酮的研究較少且很零散，尚無完整、系統(tǒng)的研究[10-12]。為了實現(xiàn)廢棄資源的合理利用和開發(fā)，減少環(huán)境污染，需要加大對玉米苞葉深加工的研發(fā)和推廣。研究玉米苞葉黃酮的提取工藝，并對其進行純化，比較和分析其抗氧化活性。通過對玉米苞葉黃酮作為天然抗氧化物質(zhì)的全面研究，為玉米苞葉深度開發(fā)和高附加值產(chǎn)品研制奠定堅實基礎(chǔ)，推動加工產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

玉米苞葉，購自徐州市區(qū)菜場，經(jīng)清洗、晾干，粉碎后過40 目篩。

維E、二丁基羥基甲苯（Butylated Hydroxy Toluene，BHT） 均為食品級，浙江一諾生物科技有限公司提供；1,1 - 二苯-2- 苦肼基（DPPH，分析純）、三吡啶三吖嗪（TPTZ，分析純）、D101 型大孔樹脂（分析純）、蘆丁標準品（純度≥98%），美國Sigma 公司提供；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、三氯化鐵、醋酸鈉、濃硫酸、無水乙醇、95%乙醇均為分析純，南京化學試劑有限公司提供。

JYL-C012 型九陽料理機，九陽股份有限公司產(chǎn)品；FA1004 型電子天平，常熟市百靈天平儀器有限公司產(chǎn)品；UV-7504 型紫外可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司產(chǎn)品；JP-100S 型恒溫超聲波振蕩儀，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃酮含量的測定

參考方敏等人[13]方法，并作適當修改。以蘆丁為標準品，配置質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 的蘆丁標準溶液，分別吸取 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 標準液，分別加入體積分數(shù)95%乙醇溶液12 mL 和質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液2 mL，靜置6 min 后，加入質(zhì)量分數(shù)10%硝酸鋁溶液2 mL，靜置6 min 后，加入質(zhì)量分數(shù)10%氫氧化鈉溶液20 mL，定容至50 mL。靜置15 min 后，于波長510 nm 處測定吸光度。以蘆丁標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.009 5X+0.000 1，R2=0.999 5，線性關(guān)系良好。取適量樣品，按上述方法操作，測定樣品中黃酮含量。

1.2.2 超聲波輔助提取法提取條件的確定

超聲波輔助法提取玉米苞葉黃酮的主要影響因素包括超聲功率、提取時間、提取溫度、提取劑乙醇體積分數(shù)和料液比，經(jīng)過前期試驗發(fā)現(xiàn)，料液比對提取效果影響不顯著，因此未將料液比列入正交試驗考查范圍內(nèi)，并確定最適料液比為1∶20。

（1） 單因素試驗。稱取干燥至恒質(zhì)量的玉米苞葉20 g，加入適量體積分數(shù)乙醇溶液，在適當超聲功率和適當溫度下提取適當時間，提取液定容至250 mL，測定提取液中黃酮的吸光度。進行單因素試驗考查超聲功率的確定值為200，300，400，500，600 W；提取時間的確定值為30，40，50，60，70 min；提取溫度的確定值為40，50，60，70，80 ℃；乙醇體積分數(shù)的確定值為40%，50%，60%，70%，80%。

（2） 正交試驗。經(jīng)過單因素試驗得到各因素水平，設(shè)計四因素三水平正交試驗確定超聲波輔助提取法最佳提取條件。

超聲波輔助提取法正交試驗見表1。

表1 超聲波輔助提取法正交試驗

根據(jù)蘆丁標準曲線計算最佳提取條件得到的提取液中黃酮含量，并計算玉米苞葉黃酮得率。得率計算方式如下：

式中：C——樣品稀釋液中黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣液體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——玉米苞葉質(zhì)量，g。

1.2.3 玉米苞葉黃酮的純化

參考徐艷陽等人[14]和王秋實[15]的方法，并作適當修改。取適量玉米苞葉黃酮提取液，上樣，靜態(tài)吸附30 min 后，以蒸餾水洗脫至無色，再用體積分數(shù)60%乙醇溶液以1.0 mL/min 流速，洗脫體積5 BV 條件下進行純化洗脫，收集流出液，測定流出液中黃酮的吸光度，合并收集吸光度最高的純化液，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥后稱質(zhì)量，并測定其黃酮含量，計算其純度。

1.2.4 DPPH 自由基清除率的測定

準確稱取玉米苞葉黃酮提純物、維E 和BHT 各0.01 g，溶解并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度0.2 mg/mL抗氧化物溶液。參考胡喜蘭等人[16]的方法，分別測定玉米須黃酮提純物、維E 和BHT 的DPPH 自由基清除率。DPPH 自由基清除率計算方式如下：

式中：A0——DPPH 溶液2 mL+無水乙醇2 mL 的吸光度；

Ai——DPPH 溶液2 mL+抗氧化物溶液2 mL的吸光度；

Aj——抗氧化物溶液2 mL+無水乙醇2 mL 的吸光度。

1.2.5 鐵離子還原能力的測定（FRAP 值法）

參考方敏等人[13]方法，并做適當修改。分別取質(zhì)量濃度0.2 mg/mL 的玉米苞葉黃酮溶液、維E 溶液和BHT 溶液0.3 mL，預熱FRAP 工作液 （由濃度為10 mmol/L TPTZ 溶液、濃度為20 mmol/L 三氯化鐵溶液、濃度為0.3 mol/L 醋酸鈉溶液按照1∶1∶10 配制而成） 至37 ℃，移取2.7 mL 與樣液混合，搖勻后放置10 min，用無水乙醇作為參比，于波長593 nm處測吸光度，以無水乙醇代替樣液加入FRAP 工作液為空白。由測得的吸光值在標準曲線上計算出的相應(yīng) FeSO4的濃度 （μmol/L） 定義為 FRAP 值。

準確量取0.060 8 g 的硫酸亞鐵使其被溶于適量的水中，加入濃度為18 mol/L 的硫酸2.5 mL，再加水稀釋至500 mL 的定容，即得濃度為800 μmol/L 的FeSO4溶液，按照此法進行稀釋，依次進行得到濃度為 12.5，25.0，37.5，50.0，75.0，100.0 μmol/L 的標準溶液，并按照樣品FRAP 值的測定步驟進行操作，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.008 5X，R2=0.999 1，線性關(guān)系良好。

1.3 統(tǒng)計分析

每組試驗均做3 次。試驗數(shù)據(jù)利用Origin10.0 軟件計算方差，差異由Duncan's 多重比較法獲得，5%為顯著水平。

目前，汽車運用與維修技術(shù)專業(yè)相關(guān)核心課程都是在學校的實訓室里，由教師演示過時的教學臺架等設(shè)備使用，然后由學生自行練習。教師以某項具體操作的熟練度和規(guī)范度對學生進行考核，而通過一遍遍的重復練習，學生往往失去學習興趣。在實訓過程中，學生對于汽車維修實際任務(wù)的實施并不熟悉，對于崗位要求也不了解，直接導致教師在教學過程中，以理論講授為主，采用滿堂灌的方式進行教學，師生互動少，學生積極性不高。最終學生的理論知識學得不夠扎實，實訓操作也沒得到有效鍛煉。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗分析結(jié)果

2.1.1 超聲功率對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

不同超聲功率對玉米苞葉黃酮提取效果的影響見圖1。

圖1 不同超聲功率對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

超聲波產(chǎn)生的機械效應(yīng)和空化作用可以幫助細胞破碎，促進玉米苞葉黃酮的溶出，改善提取效果，并且隨著超聲功率的適當增加，作用越加明顯[17]。由圖1 可知，隨著超聲功率從200 W 逐漸增加至400 W，吸光度不斷提高，說明提取率不斷增加，且呈顯著差異（p＜0.05）。超聲功率從400～600 W，吸光度沒有顯著增加，且屢有下降，可能是因為超聲功率過大產(chǎn)生的機械力過強，使得黃酮結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取效果下降[18-19]。故選擇最適超聲功率為400 W。

2.1.2 提取時間對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

不同提取時間對玉米苞葉黃酮提取效果的影響見圖2。

圖2 不同提取時間對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

由圖2 可知，隨著提取時間的延長，黃酮不斷溶出，在超聲功率400 W，提取溫度60 ℃，乙醇體積分數(shù)60%條件下，測得的吸光度越高，提取時間30～40 min 時吸光度上升幅度大 （p＜0.05）；提取時間40～60 min 吸光度趨于平緩，即黃酮溶出逐漸趨于飽和；提取時間至70 min 后，吸光度略有降低，但未形成顯著差異（p＞0.05）。可能超聲時間過長，機械力增大，破壞了黃酮的結(jié)構(gòu)，并影響其活性[20-21]。為高效提取玉米苞葉黃酮，故選擇最適提取時間為40 min。

2.1.3 提取溫度對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

不同提取溫度對玉米苞葉黃酮提取效果的影響見圖3。

圖3 不同提取溫度對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，反應(yīng)加劇，黃酮分子與乙醇分子碰撞的幾率增加，在超聲功率400 W，提取時間50 min，乙醇體積分數(shù)60%條件下，隨著提取溫度越來越高，吸光度越來越大，提取溫度40～70 ℃時吸光度持續(xù)升高，吸光度變化顯著（p＜0.05）；提取溫度在70～80 ℃的吸光度趨于穩(wěn)定，變化不顯著（p＞0.05）。另有研究發(fā)現(xiàn)，其他植物來源的黃酮類物質(zhì)在提取過程中由于溫度過高存在溶劑汽化損失，黃酮分子結(jié)構(gòu)被破壞，且雜質(zhì)大量溶出，影響黃酮提取效果的現(xiàn)象[19，22]。為減少能耗和黃酮的損失率，故選擇最適提取溫度為70 ℃。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

不同乙醇體積分數(shù)對玉米苞葉黃酮提取效果的影響見圖4。

圖4 不同乙醇體積分數(shù)對玉米苞葉黃酮提取效果的影響

按照相似相溶原理，提取物與溶劑的極性越接近，提取率越高，不同的乙醇體積分數(shù)使得其溶劑極性不同。由圖4 可知，在超聲功率400 W，提取溫度60 ℃，提取時間50 min 條件下，乙醇體積分數(shù)40%～60%時吸光度持續(xù)增加，呈顯著差異（p＜0.05）。乙醇體積分數(shù)60%～80%時，吸光度逐漸下降，且乙醇體積分數(shù)為80%的測定得到的吸光度顯著低于體積分數(shù)為60%測得的吸光度（p＜0.05）。這可能是因為乙醇體積分數(shù)的增加使得溶劑極性發(fā)生改變，加大了多糖、脂溶性物質(zhì)等其他醇溶性物質(zhì)的溶出，影響了黃酮的提取效果，故選擇最適乙醇體積分數(shù)為60%。

2.2 最佳提取條件的正交試驗分析結(jié)果

超聲波輔助提取法正交試驗結(jié)果見表2。

表2 超聲波輔助提取法正交試驗結(jié)果

由表2 可知，通過極差（R） 結(jié)果判斷出影響超聲波輔助提取法對提取液中黃酮吸光度的因素順序為提取時間＞提取溫度＞超聲功率＞乙醇體積分數(shù)。通過直觀分析得到玉米苞葉總黃酮超聲波輔助提取的最佳提取條件為A3B2C2D2，而9 組試驗中直接找出的最佳提取條件為試驗號2，即A1B2C2D2。驗證試驗結(jié)果表明，直觀分析的最佳組合A3B2C2D2條件下得到的玉米苞葉的吸光度為0.557，試驗號2 組合A1B2C2D2條件下的吸光度為0.489，兩者形成顯著差異（p＜0.05）。因此，超聲波輔助提取法最佳提取條件為超聲功率500 W，提取時間40 min，提取溫度70 ℃，提取劑乙醇體積分數(shù)60%。

經(jīng)過計算發(fā)現(xiàn)，在超聲波輔助提取法最佳提取工藝條件下玉米苞葉黃酮得率為1.083%。以該法提取得到的玉米苞葉黃酮為原料進行下一步的純化和抗氧化試驗研究。

2.3 玉米苞葉黃酮的純化分析結(jié)果

純化前后玉米苞葉黃酮純度比較見表3。

表3 純化前后玉米苞葉黃酮純度比較

將超聲波輔助提取法最優(yōu)條件下得到的玉米苞葉黃酮提取液濃縮、冷凍干燥后得到的干燥物稱質(zhì)量，并測定其黃酮含量，與純化后得到的純化物質(zhì)量及其黃酮含量比較，經(jīng)D101 型大孔樹脂純化后，玉米苞葉黃酮的純度提高了1.779 倍。

2.4 玉米苞葉黃酮的抗氧化活性分析結(jié)果

2.4.1 玉米苞葉黃酮對DPPH 自由基的清除作用

DPPH 法根據(jù)DPPH 自由基帶有單電子，波長517 nm 處有強吸收，而抗氧化物質(zhì)與單電子配對，使強吸收逐漸消失，溶液褪色，故而進行定量測定[9]。根據(jù)前期試驗研究和其他學者研究的天然植物來源黃酮對DPPH 自由基的半數(shù)抑制率（IC5）0，以維E 和BHT 為陽性對照，測定相同質(zhì)量濃度條件下，玉米苞葉黃酮提純物對DPPH 自由基的清除率。

玉米苞葉黃酮對DPPH 自由基的清除作用見圖5。

圖5 玉米苞葉黃酮對DPPH 自由基的清除作用

由圖5 可知，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的玉米苞葉黃酮提純物對DPPH 自由基的清除率為84.44%，其結(jié)果顯著高于相同質(zhì)量濃度的維E（p＜0.05），與BHT 的效果相似，但未呈現(xiàn)顯著差異（p＞0.05）。表明玉米苞葉黃酮提純物對DPPH 自由基具有較好的清除效果。

2.4.2 玉米苞葉黃酮的鐵離子還原能力

鐵離子還原能力法（FRAP 法），即在酸性條件下抗氧化物質(zhì)將Fe3+-TPTZ 還原為Fe2+-TPTZ，并呈藍紫色，在波長593 nm 處測定吸光度，計算抗氧化物質(zhì)的總抗氧化能力。

玉米苞葉黃酮的鐵離子還原能力見圖6。

圖6 玉米苞葉黃酮的鐵離子還原能力

由圖6 可知，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 玉米苞葉黃酮的FRAP 值為117.06 μmol/g，顯著高于相同質(zhì)量濃度的維 E 的 FRAP 值 （p＜0.05），與 BHT 的鐵離子還原能力相似，未呈現(xiàn)顯著差異（p＞0.05）。表明玉米苞葉黃酮具有較好的還原能力。

3 結(jié)論

（1） 超聲波輔助提取法玉米苞葉的最佳提取條件為超聲功率500 W，提取時間40 min，提取溫度70 ℃，提取劑乙醇體積分數(shù)60%；影響玉米苞葉黃酮提取效果的因素順序為提取時間＞提取溫度＞超聲功率＞乙醇體積分數(shù)。在最佳提取工藝條件下玉米苞葉黃酮得率為1.083%。

（2） 經(jīng)過D101 型大孔樹脂純化后，玉米苞葉黃酮的純度提高了1.779 倍。

（3） 與維E 和BHT 對比，玉米苞葉黃酮提純物具有較好的DPPH 自由基清除效果和還原能力。因此，玉米苞葉黃酮作為安全有效的天然抗氧化劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。