增強谷氨酸棒狀桿菌羧化途徑對有機酸產(chǎn)量的影響

陳 俊，曹 陽，汪定奇，李娟娟，易夢凡，周 衛(wèi)，吳曉琴

(武漢科技大學化學與化工學院，湖北 武漢，430081)

利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)有機酸，具有原料來源豐富、產(chǎn)品成本低廉、食用安全性高等優(yōu)點[1]，而谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)則是經(jīng)典的食品安全級微生物，其培養(yǎng)條件簡單、生長速度快，并且全基因組序列已知，遺傳背景清晰，利于遺傳改造[2-4]，經(jīng)遺傳改造的C.glutamicum可以高效用于生產(chǎn)琥珀酸[5]、丙酮酸[6]和L-蘋果酸[7]等有機酸。C.glutamicum經(jīng)糖酵解所產(chǎn)生的丙酮酸在有氧條件下經(jīng)過TCA循環(huán)最終生成草酰乙酸，在此循環(huán)中，多種有機酸如琥珀酸、富馬酸和蘋果酸等被合成；而在厭氧條件下，丙酮酸將通過還原TCA或rTCA途徑，經(jīng)草酰乙酸直接轉化成蘋果酸、富馬酸和琥珀酸，該途徑是合成四碳二羧酸得率較高的途徑，丙酮酸通過固定二氧化碳，使得理論上的糖酸轉化率高達200%[8]，因此，無論從有機酸的產(chǎn)率、安全性還是立體選擇性等方面考慮，C.glutamicum都是非常理想的有機酸生產(chǎn)菌株。不過，野生型C.glutamicum雖在代謝途徑中生成多種有機酸，但并不積累這些有機酸，故本課題組構建了阻斷乙酸和乳酸合成途徑的C.glutamicumCZ04重組菌株[9]，在此基礎上，本文采用同源重組的方法，通過引入超氧化物歧化酶基因啟動子(Psod)以增強羧化途徑的關鍵酶活性，進而強化C.glutamicum的羧化代謝途徑，同時檢測了相應有機酸的積累情況，以期為微生物發(fā)酵技術在實踐中的應用提供參考。

1 試驗

1.1 材料及重組菌株的構建

1.1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉的質量濃度分別為10、5、10 g/L，在此基礎上按15 g/L添加瓊脂粉制得LB固體培養(yǎng)基。

LBG液體培養(yǎng)基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉的質量濃度分別為10、10、5、10 g/L，在此基礎上按15 g/L添加瓊脂粉制得LBG固體培養(yǎng)基。

BHIS液體培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、腦心浸粉、山梨醇的質量濃度分別為5、2.5、5、18.5、91 g/L，在此基礎上按15 g/L添加瓊脂粉制得BHIS固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵種子液培養(yǎng)基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、NaAc的質量濃度分別為 20、5、2.5、5、2.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、NaAc、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O的質量濃度分別為20、5、0.75、0.75、5、0.5、0.2、0.02、0.005 g/L，VH和VB1的質量濃度均為0.2 mg/L。

1.1.2 主要試劑

質粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均為美國Omega公司產(chǎn)品；限制性內切酶為美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；T4 DNA ligase為寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司產(chǎn)品，fastpfuPCR Mix DNA聚合酶購自北京佳蘭生物科技有限公司；所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；乙腈(色譜純)購自國藥集團化學試劑有限公司；其它均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 重組菌株的構建

本研究所用C.glutamicum出發(fā)菌株(編號CZ04)為本課題組前期構建，C.glutamicum的部分代謝路徑如圖1所示。

圖1 C.glutamicum部分代謝流程圖

在CZ04的ppc基因前敲入超氧化物歧化酶基因啟動子(Psod)，具體步驟如下：以C.glutamicumATCC 13032的基因組DNA為模板，擴增ppc基因上、下游同源臂及Psod三個片段，采用融合PCR將上述三個片段融合，并將其克隆至pK19mobsacB載體，重組質粒命名為pK19mobsacB-Psod-ppc。采用同樣的方法構建重組質粒pK19mobsacB-Psod-pyc。

通過電轉化法[10-11]將重組質粒pK19mobsacB-Psod-ppc轉入感受態(tài)細胞CZ04中，涂布到含有卡那霉素(30 μg/mL)的BHIS固體平板上，經(jīng)初篩和復篩后，正確的重組菌株命名為CZ05，按同樣方法構建重組菌株CZ06和CZ07。本研究中所用菌株和質粒列于表1，所用引物列于表2。

表1 菌株和質粒

表2 引物

1.2 檢測方法

1.2.1 酶活測定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)酶活測定參照文獻[12-13]進行。丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PYC)酶活測定參照文獻[14-15]進行。

1.2.2 菌體密度測定

挑取新鮮的單菌落，接種到LBG培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液接種到種子培養(yǎng)基中并測定菌液初始OD600的值，之后每3 h測一次菌液濃度，直至衰亡期，每種菌株設置3個平行樣。測定過程中，將菌液稀釋一定的倍數(shù)，使用752N型紫外可見分光光度計檢測細胞生長量，檢測波長為600 nm。

1.2.3 葡萄糖濃度及有機酸含量測定

菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中轉厭氧培養(yǎng)時，每12 h檢測葡萄糖的濃度，所用儀器為SBA-40E型葡萄糖分析儀。

使用P680型高效液相色譜儀檢測樣品中的L-蘋果酸、琥珀酸及丙酮酸含量，分析條件為：色譜柱為AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為KH2PO4、乙腈混合液二者體積比為99∶1， KH2PO4濃度為20 mmol/L，進樣量為20 μL，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃，流速為0.5 mL/min。

2 結果與討論

2.1 菌株的鑒定

菌株CZ05、CZ06及CZ07的PCR鑒定結果如圖2所示。已知用于同源重組的上、下游同源臂片段大小約為500 bp，psod片段大小約為200 bp。由圖2(a)中的泳道1可知，當以重組菌株CZ05的基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2擴增時，擴增產(chǎn)物為上游同源臂、啟動子和下游同源臂三者融合片段，擴增條帶大小介于1000～2000 bp之間，這與理論值1200bp相吻合；由圖2(a)中的泳道2可知，當以對照菌株CZ04的基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2擴增時，擴增產(chǎn)物為上、下游同源臂融合片段，因缺乏sod基因啟動子，該片段介于1000～2000 bp之間但略小于泳道1相應值，這也與理論值(1000 bp)相一致；由圖2(a)中的泳道3可知，當以CZ05基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和啟動子引物sod-ppc-U2擴增時，擴增產(chǎn)物為上游同源臂、啟動子二者融合片段，擴增條帶大小介于500～1000 bp之間，這仍與理論值(700 bp)相吻合；圖2(a)中的泳道4所示為以CZ04基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和啟動子引物sod-ppc-U2擴增時的情形，由于對照菌株CZ04的ppc基因前面缺乏sod基因啟動子，故而不能擴增出產(chǎn)物；圖2(a)中的泳道5所示為以CZ05基因組DNA為模板、以啟動子引物sod-ppc-U1和同源臂引物ppcD2進行擴增時的情形，擴增產(chǎn)物為啟動子、下游同源臂融合片段，實測值與理論預期值(700 bp)一致，而對照菌株CZ04則未能擴增出條帶(見圖2(a)泳道6)。綜合上述結果可以判斷，sod基因啟動子已成功敲入到ppc基因前面。至于重組菌株CZ06、CZ07，相應的鑒定結果(分別見圖2(b)、圖2(c))也均與預期相符，此處不再贅述。

(a)CZ05 (b)CZ06

(c)CZ07

2.2 酶活檢測結果與分析

PCR鑒定證實sod基因啟動子已成功敲入相應的靶基因前面，為了確定sod基因啟動子是否能夠增強靶基因表達，對靶基因ppc和pyc的編碼產(chǎn)物進行了酶活檢測與分析，結果如圖3所示。由圖3可見，與對照菌株CZ04相比，單獨上調ppc基因的重組菌株CZ05，其PPC酶活提高了62%，而PYC酶活則略有降低；單獨上調pyc基因的菌株CZ06，其PYC酶活提高了116%，PPC酶活也略有升高；同時上調ppc和pyc基因的菌株CZ07，其PPC酶活提高了67%，PYC酶活提高了120%。檢測結果表明，將C.glutamicum超氧化物歧化酶基因sod啟動子敲入ppc和pyc基因的上游，可以有效提高PPC和PYC這兩種酶的活性，尤其對PYC酶活的促進作用更為顯著，并且ppc和pyc基因雙上調的菌株CZ07，其PPC和PYC酶活均高于單獨上調ppc或pyc基因的菌株CZ05及CZ06。

(a)PYC

(b)PPC

2.3 菌株的生長特性

菌株CZ04、CZ05、CZ06、CZ07分別在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長情況檢測結果如圖4所示。從圖4(a)中可以看出，各菌株在種子培養(yǎng)基中經(jīng)搖瓶培養(yǎng)12 h后，相應生長周期均進入對數(shù)生長末期，其中對照菌株CZ04的生長速度最快，在培養(yǎng)15 h時即達到最大值，之后進入平臺期。菌株CZ05、CZ06、CZ07生長速度達到最大值的時刻均比CZ04滯后約6 h，但四者的最大生物量沒有顯著差異。另外，單獨上調PYC的CZ06與單獨上調PPC的CZ05及PPC、PYC雙上調的CZ07相比，前者的最大生物量較后兩者略高，并且后兩者最大生物量非常接近，這表明PPC的上調對菌株生長的影響占主導作用。從圖4(b)中可看出，4種菌株都以較快速度在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長，在培養(yǎng)階段前18 h內，各菌株生長速度幾乎相同，且均在培養(yǎng)24 h時達到最大濃度，此時轉厭氧發(fā)酵效果最好。菌株按最大濃度由高到低排序，依次為CZ04、CZ06、CZ05、CZ07。綜上所述，Psod啟動子的敲入，雖大幅提高了PPC和PYC的酶活，但對菌株的生長速度卻沒有明顯影響，這對于目的產(chǎn)物的積累是有利的。

(a)種子培養(yǎng)基

(b)發(fā)酵培養(yǎng)基

2.4 增強C.glutamicum羧化途徑對有機酸積累的影響

為了考察增強羧化途徑對有機酸積累的影響，將菌株在厭氧條件下培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液中有機酸的成分和濃度測試結果如圖5所示，相應葡萄糖消耗量見圖6。由圖5及圖6數(shù)據(jù)計算可知，與出發(fā)菌株CZ04相比，單獨上調PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06，其相應的L-蘋果酸產(chǎn)率分別提高了63.2%和29.2%，琥珀酸產(chǎn)率分別提高了25%和23.2%，而丙酮酸產(chǎn)率則分別下降了38.6%和18.0%，總產(chǎn)酸率分別提高了7.2%和4.8%，同時，葡萄糖消耗量分別提高了11.1%和5.5%。因此，當Psod分別單敲入時，相應的總產(chǎn)酸率及葡萄糖消耗量均有一定程度的增加，這表明強啟動子的敲入增強了CZ05、CZ06的羧化代謝通路，使磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸更多地轉化為草酰乙酸，再通過草酰乙酸進一步生成L-蘋果酸及下游產(chǎn)物琥珀酸，而L-蘋果酸的生成更依賴于丙酮酸的消耗轉化。當同時上調PPC和PYC獲得CZ07時，相應L-蘋果酸產(chǎn)率提高了63.7%，丙酮酸產(chǎn)率下降了32.6%，琥珀酸的產(chǎn)率提高了35.7%，總產(chǎn)酸率提高了11.8%，葡萄糖消耗量提高了22.2%，總產(chǎn)酸率和葡萄糖消耗量的提升效果均優(yōu)于單一上調PPC或PYC時的效果，這表明菌株CZ07的羧化途徑在菌株CZ05和CZ06的基礎上進一步得到強化。

圖5 有機酸的檢測

圖6菌株的葡萄糖消耗

通過對野生型菌株進行代謝途徑優(yōu)化來提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)率，一般有以下兩個策略：第一，阻斷底物流向非目標產(chǎn)物，即阻斷底物的消耗；第二，加速底物向目標產(chǎn)物的轉化。在本研究中，通過在催化底物向目標產(chǎn)物轉化的關鍵酶基因前敲入強啟動子Psod，增強關鍵酶活性，進而加速催化底物向產(chǎn)物的轉化。需要指出的是，雖然pyc和ppc基因前面敲入的都是sod基因啟動子，但本研究結果表明，敲入sod基因啟動子對PYC酶活性的提升作用較其對PPC酶活性的提升作用更強，這應歸因于PPC酶活會被胞內多種物質抑制[16]，在C.glutamicum中，二羧酸代謝產(chǎn)物對PPC酶活均有一定的抑制作用，天冬氨酸和蘋果酸是PPC的強抑制劑，尤其天冬氨酸的抑制效果更強[17]。不過，在PPC中有一種氨基酸取代物D299N，可以減輕天冬氨酸的反饋抑制，提高草酰乙酸生成量以增強TCA循環(huán)并提高谷氨酸的產(chǎn)量[16]，這意味著PPC酶活性的提高，除了借助引入強啟動子外，還可以聯(lián)合使用有效的PPC拮抗抑制劑，從而最大限度地釋放PPC的活性。此外，本研究中PPC酶活是在粗酶液條件下檢測的，粗酶液中可能有一些成分會抑制PPC酶活性，導致測量值低于相應實際值。再則，在實際發(fā)酵生產(chǎn)過程中，胞內有機酸如蘋果酸和天冬氨酸等的積累也會嚴重抑制PPC的活性，同時對其它關鍵酶亦有抑制作用[18-19]，造成有機酸合成能力下降。上調PPC和PYC，有利于有機酸的生成和積累，但是高濃度的有機酸又對PPC和PYC形成反饋抑制，因此，盡快地轉移產(chǎn)物，減少產(chǎn)物反饋抑制，也是大量生產(chǎn)目標產(chǎn)物時必須考慮的因素。在本研究中，單獨上調PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06都能有效提高有機酸的產(chǎn)量，而PPC、PYC雙上調的菌株CZ07，其PPC、PYC酶活以及產(chǎn)生有機酸的能力均高于PPC或PYC單獨上調的菌株，這表明PPC和PYC可能在谷氨酸棒狀桿菌的糖酸轉換中存在協(xié)同作用。單獨上調PPC或PYC時，菌株CZ05的PPC酶活提高了62%，而菌株CZ06的PYC酶活則提高了116%，但菌株CZ05產(chǎn)酸量卻較菌株CZ06相應值高2.26%，這表明C.glutamicum在厭氧發(fā)酵過程中，PPC較PYC的羧化作用更強，當兩者同時過表達時發(fā)揮了協(xié)同作用。但是，增強羧化途徑后，相應L-蘋果酸產(chǎn)量及葡萄糖消耗量的增幅并不是特別顯著，這可能是有機酸的累積形成了較強的產(chǎn)物反饋抑制所致，因為在通常情況下，有機酸不會自發(fā)分泌到胞外。為了提高有機酸分泌到胞外的量，可以嘗試改變發(fā)酵培養(yǎng)基成分，增加細胞壁的通透性，使胞內積累的物質更容易分泌到胞外，或者過表達有機酸轉運蛋白，及時將產(chǎn)物運出細胞，這對持續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物具有重要意義。

3 結語

利用同源重組的方法，在本課題組前期所構建菌株C.glutamicumCZ04的ppc和pyc基因前敲入強啟動子Psod，成功構建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)單獨上調的重組菌株CZ05、丙酮酸羧化酶(PYC)單獨上調的重組菌株CZ06以及PPC、PYC同時上調的重組菌株CZ07。經(jīng)酶活檢測，相比出發(fā)菌株CZ04，重組菌株CZ05的PPC 酶活提高了62%， CZ06的PYC 酶活提高了116%，而CZ07的PPC、PYC酶活則分別提高了67%、120%，三種重組菌株對應的有機酸得率分別為1.358、1.328、1.416 mol/mol葡萄糖。這表明，強啟動子的引入有效提高了羧化途徑關鍵酶活性，進而強化了C.glutamicum通過羧化途徑產(chǎn)酸的能力，同時發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下，上調PPC比上調PYC更有利于有機酸的積累。在本研究中，積累有機酸能力最強的是PPC和PYC同時上調的重組菌株CZ07，該菌株在厭氧發(fā)酵72h時L-蘋果酸、琥珀酸的積累量分別達到0.761、0.228 mol/mol葡萄糖，主要副產(chǎn)物為丙酮酸。