• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的左金丸治療肝癌機(jī)制探討

    2021-03-17 03:43:12莫嘉浩許洪彬李菁李金生綦向軍鐘崇
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2021年2期
    關(guān)鍵詞:金丸吳茱萸藥理學(xué)

    莫嘉浩,許洪彬,李菁,李金生,綦向軍,鐘崇

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的左金丸治療肝癌機(jī)制探討

    莫嘉浩1,許洪彬1,李菁2,李金生3,綦向軍4,鐘崇5

    1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;5.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

    運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究左金丸治療原發(fā)性肝癌的作用機(jī)制。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)獲取左金丸的化合物及靶點(diǎn),以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為閾值進(jìn)行化合物篩選,將靶點(diǎn)輸入U(xiǎn)niprot獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因Symbol;從人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards:The Human Gene Database)獲取原發(fā)性肝癌的疾病基因,并篩選出與左金丸靶點(diǎn)基因的交集基因;運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)、疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)(基因)網(wǎng)絡(luò)圖;運(yùn)用String構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),運(yùn)用g:Profiler數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行GO富集及KEGG通路富集分析;聯(lián)合主要化合物、交集基因與通路分析結(jié)果,繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。篩選得到左金丸化合物41種、交集基因111個(gè),剔除不含交集基因(靶點(diǎn))的化學(xué)成分后得到化合物31種,槲皮素、黃連素、吳茱萸堿等為左金丸的主要活性成分,AKT1、TP53、HSP90AA1等為主要作用靶點(diǎn)。GO富集分析共獲得條目136條,涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體結(jié)合、調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合等多個(gè)生物過程,KEGG富集分析得到165條通路。左金丸通過多靶點(diǎn)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、IL-17信號(hào)通路等治療原發(fā)性肝癌。經(jīng)生物信息學(xué)的基因芯片驗(yàn)證,結(jié)果基本相符。

    左金丸;原發(fā)性肝癌;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);信號(hào)通路

    原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤[1],全球病死率居惡性腫瘤第三位[2]。2015年報(bào)道,我國肝癌發(fā)病率為466.1/10萬,病死率為422.1/10萬[3]。因其具有發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、復(fù)發(fā)快、預(yù)后差等特點(diǎn)[4],故防治是臨床研究重點(diǎn)。

    左金丸出自《丹溪心法》,由黃連、吳茱萸組成,主要用于肝火犯胃之嘔吐、脅痛等。藥理學(xué)研究表明,其水煎液可通過阻斷AP-1等通路有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖,也可通過誘導(dǎo)線粒體凋亡以抗癌[5-6]。有miRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),黃連、吳茱萸的主要有效成分黃連素與吳茱萸堿聯(lián)用具有抗癌作用[7]。目前雖已確認(rèn)黃連素和吳茱萸堿分別為黃連、吳茱萸的抗腫瘤活性成分[8],但中藥成分復(fù)雜,靶點(diǎn)眾多,尚需進(jìn)一步分析?,F(xiàn)有研究認(rèn)為,左金丸作用靶點(diǎn)可能涉及癌癥、肝病、代謝、炎癥等,與癌癥尤為相關(guān)[8],但針對(duì)特定疾病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究仍欠缺。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的多成分、多靶點(diǎn)、多通路分析方法,全面闡釋左金丸治療肝癌的機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 左金丸化合物與靶點(diǎn)獲取

    運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別查找黃連、吳茱萸,獲取相應(yīng)的化合物。以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為條件進(jìn)行化合物篩選,以提高數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠性[10-13]。運(yùn)用TCMSP查找所得化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息,將結(jié)果輸入U(xiǎn)niprot(http://www.uniprot.org/),獲取靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因Symbol。

    1.2 肝癌疾病基因獲取

    以“hepatocellular carcinomas”“l(fā)iver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”“hepatic carcinoma”為關(guān)鍵詞,從人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards:The Human Gene Database,https://www.genecards.org/)獲取肝癌的疾病基因,與左金丸的靶點(diǎn)基因?qū)Ρ群蠛Y選出二者的交集基因。GeneCards數(shù)據(jù)庫集合已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、組學(xué)檢測驗(yàn)證的基因與疾病關(guān)系信息,具有全面性、權(quán)威性,并通過GIFtS算法對(duì)基因-疾病的相關(guān)度進(jìn)行排序[14],其Relevance score有助于從特定疾病對(duì)應(yīng)的諸多靶點(diǎn)中篩選出相關(guān)度更高的靶點(diǎn)[15]。設(shè)置Relevance score≥10,提取高關(guān)聯(lián)度靶點(diǎn)基因。

    1.3 活性成分-靶點(diǎn)、疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)(基因)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    獲取交集基因后,對(duì)化合物進(jìn)行反向篩選,剔除靶點(diǎn)基因中不含交集基因的化合物,運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)、疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)(基因)網(wǎng)絡(luò)圖,并采用該軟件的network analyzer模塊進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。

    1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    將所得交集基因輸入String數(shù)據(jù)分析平臺(tái)(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白相互作用(protein- protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)分析,分析模式設(shè)定為“Multiple proteins”,物種限定為“Homo sapiens”。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)讀后,設(shè)置置信度≥0.99,并隱藏孤立蛋白,最后輸出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

    運(yùn)用g:Profiler數(shù)據(jù)分析平臺(tái)(https://biit.cs.ut.ee/ gprofiler/gost)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,將物種限定為“Homo sapiens”,采用g:SCS算法進(jìn)行值的校正。g:SCS算法是g:Profile團(tuán)隊(duì)開發(fā)的用于計(jì)算GO和KEGG富集分析所得值的多重測試校正方法,與Bonferroni及False Discovery Rate等校正方法相比,該算法考慮到每個(gè)生物體術(shù)語注釋下的潛在基因集合結(jié)構(gòu),提供了一個(gè)更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)拈撝礫7],篩選校正后<0.05的富集結(jié)果。運(yùn)用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化,R軟件繪制靶點(diǎn)-通路干預(yù)機(jī)制圖。

    1.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

    結(jié)合主要成分、核心靶點(diǎn)與KEGG分析所得通路,運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件繪制成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖,分析其整體關(guān)聯(lián)。

    1.7 肝癌基因樣本獲取

    為進(jìn)一步驗(yàn)證基因的準(zhǔn)確性,以“hepatocellular carcinomas”“l(fā)iver cancer”“hepatoma”“hepatic cancer”為關(guān)鍵詞,檢索美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),篩選有關(guān)人類肝癌基因的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。然后使用R軟件(3.6.1)中的affy軟件包(1.62.0),將mRNA的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可識(shí)別格式,通過Robust-Multi-Array(RMA)方法進(jìn)行背景矯正和標(biāo)準(zhǔn)化處理,最終得到標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)值矩陣,用于后續(xù)的差異表達(dá)分析。

    1.8 篩選并驗(yàn)證差異表達(dá)基因

    利用R軟件中l(wèi)imma函數(shù)包篩選肝癌樣品中的差異表達(dá)mRNAs。篩選閾值為<0.05和|log2FC|>0.5,繪制火山圖,并在樣品中進(jìn)行差異表達(dá)mRNAs的雙向聚類分析。將差異基因與左金丸基因取交集,再與研究結(jié)果的肝癌-左金丸交集基因結(jié)果對(duì)比,驗(yàn)證準(zhǔn)確性。

    2 結(jié)果

    2.1 左金丸化學(xué)成分及靶點(diǎn)

    以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件,共獲得左金丸活性成分44種,其中黃連14種、吳茱萸30種,去除重復(fù)成分后共41種。轉(zhuǎn)換后得到靶點(diǎn)基因黃連287個(gè)、吳茱萸330個(gè),去除重復(fù)后得到靶點(diǎn)基因187個(gè)。從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得肝癌疾病基因共8567種,高關(guān)聯(lián)度靶點(diǎn)基因1196個(gè)。對(duì)疾病靶點(diǎn)和左金丸靶點(diǎn)經(jīng)人工校對(duì)后取交集,獲得基因111個(gè),剔除不含交集基因(靶點(diǎn))的化學(xué)成分,得到相關(guān)化學(xué)成分31種,其中黃連7種、吳茱萸22種,二者共有成分2種,見表1。

    2.2 可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    2.2.1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    采用Cytoscape3.7.1軟件對(duì)左金丸中具有靶點(diǎn)的化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖1。該網(wǎng)絡(luò)共142個(gè)點(diǎn),包括化合物31個(gè)、靶點(diǎn)基因111個(gè),其相互作用用連線表示。利用Cytoscape軟件Network Analyzer插件中的Visualize Parameters對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行處理,節(jié)點(diǎn)大小代表Degree的大小,邊的粗細(xì)代表Edge Betweenness的大小。其中5個(gè)靶點(diǎn)基因Degree>20,提示這些靶點(diǎn)基因可能在左金丸中起主要藥效作用。

    2.2.2 疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    采用Cytoscape3.7.1軟件繪制左金丸治療肝癌疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)(基因)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖2。

    注:黃色代表化合物,紫色代表靶點(diǎn)基因

    注:綠色代表交集基因,黃色代表化合物;左下方為Degree<3的集合,右下方為Degree≥3的集合

    2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

    將左金丸治療肝癌的靶點(diǎn)基因?qū)隨tring11.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析,PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3。62個(gè)蛋白存在85條相互作用關(guān)系。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件并利用cytoHubba插件分析網(wǎng)絡(luò)中基因的重要性,排名前20位的關(guān)鍵基因見表2。

    表2 左金丸治療肝癌的關(guān)鍵基因(前20位)

    2.4 GO功能富集分析

    GO功能富集分析共獲得符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的條目136條,對(duì)富集基因數(shù)前20位的條目進(jìn)行可視化,以條形的長度代表相應(yīng)條目所富集基因數(shù),結(jié)果見圖4。

    2.5 KEGG通路富集分析

    對(duì)左金丸治療肝癌的111個(gè)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,值排序前10位的通路見表3,前20位通路富集氣泡圖見圖5。此外,對(duì)KEGG結(jié)果進(jìn)行預(yù)讀后發(fā)現(xiàn),與肝癌密切相關(guān)的通路有PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、丙型肝炎通路,運(yùn)用R軟件加載Bioconductor包對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、IL-17信號(hào)通路進(jìn)行靶點(diǎn)-通路機(jī)制分析,以紅色標(biāo)記代表左金丸可能進(jìn)行干預(yù)的潛在靶點(diǎn),結(jié)果見圖6~圖8。

    表3 左金丸治療肝癌基因KEGG通路富集(前10位)

    圖4 左金丸治療肝癌基因GO功能富集條形圖(前20位)

    圖5 左金丸治療肝癌基因KEGG通路富集氣泡圖(前20位)

    圖6 左金丸治療肝癌乙型肝炎通路分析

    圖7 左金丸治療肝癌IL-17信號(hào)通路分析

    圖8 左金丸治療肝癌PI3K-Akt信號(hào)通路分析

    2.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

    通過文獻(xiàn)檢索與閱讀,在前20位的KEGG通路中篩選出可能與肝癌相關(guān)的通路,并將其與左金丸的活性成分、作用靶點(diǎn)結(jié)合,構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路多維網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見圖9。

    注:黃色代表藥物,藍(lán)色代表與肝癌相關(guān)的活性成分,綠色代表潛在靶點(diǎn),紫色代表與肝癌相關(guān)通路

    2.7 肝癌基因樣本

    符合條件的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集為GSE54238,包括10個(gè)正常樣本和13個(gè)肝癌樣本,檢測平臺(tái)為GPL16955(Arraystar human lncRNA microarray V1-100309)。

    2.8 差異表達(dá)基因驗(yàn)證

    篩選后得到差異表達(dá)的mRNAs共2382個(gè),其中表達(dá)上調(diào)1182個(gè),表達(dá)下調(diào)1200個(gè),組間差異火山圖見圖10。差異基因與左金丸基因取交集后得到29個(gè)交集基因,與“2.1”項(xiàng)下交集基因?qū)Ρ?,?8個(gè)基因重疊,包括AKT1、AR、CCNA2、CCNB1、CDK2、CTSD、CYP3A4、E2F1、EGFR、FOS、HSP90AA1、KDR、NR1I2、ODC1、PON1、RXRA、STAT1、TP53。經(jīng)對(duì)比驗(yàn)證,該18個(gè)基因?yàn)樽蠼鹜?肝癌關(guān)鍵基因,亦位于前述PPI網(wǎng)絡(luò)圖中核心位置。

    圖10 肝癌差異表達(dá)mRNA火山圖

    3 討論

    左金丸有瀉肝火、開痞結(jié)之功,其中黃連燥濕瀉火解毒,吳茱萸溫中散寒止痛,二者相配,寒熱并用,辛開苦降,使肝火得清,胃氣得降,濕邪得化。

    本研究借助TCMSP平臺(tái),篩選得到左金丸活性成分41種,藥物靶點(diǎn)基因187個(gè);將其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與肝癌的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比,獲得交集基因111個(gè),篩選得到潛在化合物31種,其中部分化合物的有效性及作用機(jī)制已被證實(shí)。黃連、吳茱萸均富含檞皮素和黃連素。槲皮素是一種強(qiáng)大的自由基清除劑,能抑制人體內(nèi)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的增殖[16],國外研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)TP53以抑制肝癌細(xì)胞增殖[17],與本研究PPI網(wǎng)絡(luò)所得關(guān)鍵基因靶點(diǎn)結(jié)果一致。黃連素主要通過AMP-活化蛋白激酶促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[18],一項(xiàng)關(guān)于黃連素干預(yù)肝癌細(xì)胞的研究顯示,黃連素可通過上調(diào)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)選擇性促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬性死亡,并發(fā)現(xiàn)AFT6很可能是黃連素的新靶點(diǎn)[19]。黃連中OB值最高的化合物巴馬汀可通過抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子反應(yīng)以減輕小鼠肝損傷程度[20],體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其具有抗癌活性[21]。吳茱萸中OB值最高的吳茱萸堿可通過促進(jìn)腫瘤壞死因子(TNF-α)的生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期變化而發(fā)揮抗癌作用[22],TNF是Degree≥3的重要基因靶點(diǎn)之一。吳茱萸主要活性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿、羥基吳茱萸堿等均屬于生物堿類化合物,具有抗腫瘤作用[23]。上述化合物多數(shù)具有較高的度值,位于左金丸治療肝癌疾病-中藥-化合物-交集靶點(diǎn)(基因)網(wǎng)絡(luò)的核心,提示這些化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因可能在左金丸抗肝癌過程中起主要作用。

    活性成分與交集靶點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)可確定核心治療靶點(diǎn)。AKT1、TP53、CDKN1A、HSP90AA1等是左金丸治療肝癌的核心靶點(diǎn)。AKT是PI3K-Akt信號(hào)通路的重要橋梁點(diǎn)[24],而PI3K-Akt信號(hào)通路被越來越多的研究證明在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[25-27],也是本研究KEGG通路富集結(jié)果中計(jì)數(shù)最多的通路。有研究顯示,TP53突變在HBV感染導(dǎo)致的肝癌中有重要意義[28],其HBV致癌通路也是本研究的KEGG通路富集結(jié)果之一。CDKN1A編碼一種蛋白依賴性的激酶抑制劑,編碼的蛋白可阻滯細(xì)胞周期于G1期,CDKN1A表達(dá)受抑癌蛋白p53的嚴(yán)格控制,有研究發(fā)現(xiàn)其可聯(lián)合端粒酶以抑制腫瘤增殖[29]。HSP90AA1居于PPI網(wǎng)絡(luò)中心區(qū)域,有研究發(fā)現(xiàn)其在中重度抑郁組肝癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)[30],且與肝癌患者的腫瘤臨床分期存在一定相關(guān)性[31]。

    本研究經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)確定核心靶點(diǎn)后,進(jìn)行GO功能富集分析以探討其具體的功能作用,結(jié)果主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體結(jié)合、調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合等過程。此外,泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding,adj=3.68×10-9)、血紅素結(jié)合(heme binding,adj=4.55×10-9)等亦為重要的生物過程,參與抑制癌細(xì)胞增殖,預(yù)防肝臟癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)展[32-33]。

    本研究通過KEGG通路富集分析追蹤左金丸治療肝癌的代謝通路,并作成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析整體聯(lián)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),左金丸主要作用于PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、IL-17信號(hào)通路、丙型肝炎通路。PI3K-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長、存活、增殖、凋亡等過程,對(duì)多種癌癥具有重要的調(diào)控作用[34],其以AKT靶點(diǎn)為樞紐,抑制PI3K-Akt信號(hào)通路中AKT表達(dá),從而抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[35],而AKT在左金丸治療肝癌PPI網(wǎng)絡(luò)中有重要地位。在乙型肝炎通路圖中可見左金丸對(duì)其中的肝癌侵襲轉(zhuǎn)移通路(HCC invasion and metastasis)、肝癌發(fā)展通路(HCC development)等進(jìn)行調(diào)節(jié),靶點(diǎn)基本占據(jù)通路的重要節(jié)點(diǎn)。IL-17是一種與固有性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子,IL-17升高與肝癌的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)[36],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明IL-17可通過拮抗γ-干擾素促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[37]。左金丸治療肝癌IL-17信號(hào)通路圖中,左金丸的作用靶點(diǎn)基本覆蓋IL-17通路各段,可見,IL-17的調(diào)節(jié)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系,有助于驗(yàn)證相關(guān)臨床研究[37]。成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖顯示,槲皮素(MOL000098,quercetin)的化合物-藥物、化合物-靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)度最高,與潛在核心化合物挖掘結(jié)果相符,可進(jìn)一步證實(shí)其為左金丸治療肝癌的核心活性成分。

    綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),槲皮素、黃連素、吳茱萸堿為左金丸的主要活性成分,經(jīng)基因芯片驗(yàn)證,核心靶點(diǎn)以AKT1、TP53、HSP90AA1等為主,涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體結(jié)合、調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合等多個(gè)生物過程,并通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、IL-17信號(hào)通路發(fā)揮抗癌作用。本研究對(duì)闡明左金丸治療肝癌及預(yù)防其轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制具有借鑒意義,但結(jié)論仍待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證。

    [1] 葛均波,徐永健.內(nèi)科學(xué):第8版[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:429-430.

    [2] FERLAY J, SOERJOMATARAM I, DIKSHIT R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide:sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer,2015,136(5):E359-E386.

    [3] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

    [4] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(8):1419-1431.

    [5] 王旭,徐蓓蕾,吳迪,等.不同配伍比例的黃連-吳茱萸藥對(duì)研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2020,26(3):21-30.

    [6] CHOU S T, HSIANG C Y, LO H Y, et al. Exploration of anti-cancer effects and mechanisms of Zuo-Jin-Wan and its alkaloid components in vitro and in orthotopic HepG2 xenograft immunocompetent mice[J]. BMC Complement Altern Med,2017,17(1):121.

    [7] 尹作靜,曹志偉,閆鑫淼,等.黃連素和吳茱萸堿協(xié)同抗癌的miRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2017,33(6):772-780.

    [8] 周祥羽,鄒忠杰.左金丸化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究進(jìn)展[J].廣東化工, 2017,44(10):89-90.

    [9] 楊淑慧,譚梅傲,鄺衛(wèi)紅,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討左金丸的作用機(jī)制[J].山東中醫(yī)雜志,2019,38(7):694-700.

    [10] 劉璐,徐士欣,張軍平,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討四妙勇安湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2019,37(3):572-578.

    [11] 馬穎,劉志強(qiáng),易增興,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析防風(fēng)-烏梅藥對(duì)治療蕁麻疹的作用機(jī)制[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2019,36(21):2666-2672.

    [12] 覃玉冰,林煒基,曾廣必,等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測白花蛇舌草治療肝癌的分子機(jī)制[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2019,36(8):1236-1241.

    [13] LIU J, LIU J, SHEN F, et al. Systems pharmacology analysis of synergy of TCM:an example using saffron formula[J]. Sci Rep, 2018,8(1):380.

    [14] HAREL A, INGER A, STELZER G, et al. GIFtS:annotation landscape analysis with GeneCards[J]. BMC Bioinformatics,2009,10:348.

    [15] STELZER G, ROSEN N, PLASCHKES I, et al. The GeneCards suite:From gene data mining to disease genome sequence analyses[J]. Curr Protoc Bioinformatics,2016,54:1-30.

    [16] 牛壯.檞皮素抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(6):729-731.

    [17] YOUNESS R A, ASSAL R A, EZZAT S M, et al. A methoxylated quercetin glycoside harnesses HCC tumor progression in a TP53/ miR-15/miR-16 dependent manner[J]. Nat Prod Res,2020,34(10):1475-1480.

    [18] 高斯,趙相軒,盧再鳴.中藥化合物治療肝細(xì)胞肝癌分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2018,26(16):2631-2635.

    [19] LA X, ZHANG L, LI Z, et al. Berberine-induced autophagic cell death by elevating GRP78 levels in cancer cells[J]. Oncotarget, 2017,8(13):20909-20924.

    [20] LEE W C, KIM J K, KANG J W, et al. Palmatine attenuates D-galactosamine/lipopolysaccharide-induced fulminant hepatic failure in mice[J]. Food Chem Toxicol,2010,48(1):222-228.

    [21] 唐超玲,鄭華,王捷,等.基于組效關(guān)系的壯藥巖黃連提取物抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721活性成分辨識(shí)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2016,27(10):2372-2375.

    [22] 王曉娜.黃連與吳茱萸配伍抗腫瘤相互作用的初步研究[D].大連:大連醫(yī)科大學(xué),2009.

    [23] NWODO J N, IBEZIM A, SIMOBEN C V, et al. Exploring cancer therapeutics with natural products from African medicinal plants, Part Ⅱ:Alkaloids, terpenoids and flavonoids[J]. Anticancer Agents Med Chem,2016,16(1):108-127.

    [24] 陳晶.靶向封閉AKT1抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移的研究[D].青島:青島大學(xué),2017.

    [25] MARTELLI A M, TABELLINI G, BRESSANIN D, et al. The emerging multiple roles of nuclear Akt[J]. Biochim Biophys Acta,2012, 1823(12):2168-2178.

    [26] XU N, LAO Y, ZHANG Y, et al. Akt:a double-edged sword in cell proliferation and genome stability[J]. J Oncol,2012,2012:951724.

    [27] HERS I, VINCENT E E, TAVARE J M. Akt signalling in health and disease[J]. Cell Signal,2011,23(10):1515-1527.

    [28] 張馨月.TP53、CTNNB1、CDKN2A基因改變與福建省HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌的關(guān)系[D].福州:福建醫(yī)科大學(xué),2017.

    [29] GUPTA R, DONG Y, SOLOMON P D, et al. Synergistic tumor suppression by combined inhibition of telomerase and CDKN1A[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(30):E3062-E3071.

    [30] 韋玨伶,向驍,趙凌云,等.HSP90AA1/HSPA8在合并抑郁情緒的肝癌患者中的表達(dá)及臨床意義[J].中國腫瘤,2019,28(5):387-394.

    [31] 徐慶年,陸云飛,湯伯宗,等.HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌腫瘤組織中熱休克蛋白mRNA表達(dá)水平與腫瘤分期的相關(guān)性分析[J].臨床肝膽病雜志,2017, 33(5):869-874.

    [32] 朱芳成,畢華強(qiáng),趙毅,等.乙型肝炎病毒核心蛋白觸發(fā)人肝癌細(xì)胞異常卟啉代謝的機(jī)制[J].病毒學(xué)報(bào),2019,35(4):592-598.

    [33] 何禮蓮,丁聲達(dá),付豪,等.血紅素加氧酶對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控因子CDK4和cyclinD1的影響[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志,2019,6(27):48-49.

    [34] JIANG J, ZHANG Y, GUO Y, et al. MicroRNA-3127 promotes cell proliferation and tumorigenicity in hepatocellular carcinoma by disrupting of PI3K/AKT negative regulation[J]. Oncotarget,2015, 6(8):6359-6372.

    [35] 曹煜姍,孫達(dá)權(quán),夏慶,等.PI3K/Akt通路在肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用[J].山東醫(yī)藥,2018,58(26):14-17.

    [36] 盧柑汕,石光英,亓英超,等.原發(fā)性肝癌患者血清IGF-1、IL-17、AFP水平測定分析[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2018,18(46):8-9.

    [37] 李杰,閆堃,楊屹,等.白介素-17通過拮抗γ-干擾素的作用促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞的生長與增殖[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2019,39(1):1-5.

    Discussion on Mechanism ofPills in Treatment of Hepatocellular Carcinoma Based on Network Pharmacology

    MO Jiahao1, XU Hongbin1, LI Jing2, LI Jinsheng3, QI Xiangjun4, ZHONG Chong5

    To study the mechanism ofPills in the treatment of hepatocellular carcinoma based on network pharmacology.The compounds and targets ofPills were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The compounds were screened by oral bioavailability (OB) ≥30% and drug-like (DL) ≥0.18 as thresholds, and the targets were input into Uniprot to obtain the gene Symbol. The disease target genes of hepatocellular carcinoma were obtained from GeneCards: The Human Gene Database, and intersection genes of target genes ofPills were screened. Cytoscape3.7.1 software was used to draw network diagrams of active ingredient-target and disease-TCM-compound-intersection target (gene). The protein-protein interaction relationship network was constructed by String. GO enrichment and KEGG pathway enrichment were analyzed by g:Profiler data analysis platform. Combined with the analysis resultsof major compounds, intersection genes and pathways, the component-target-pathway network diagram was drawn.Totally 41 compounds and 111 intersection genes ofPills were obtained and chemical components without intersection genes (targets) were removed, and 31 compounds were finally screened. Quercetin, berberine, evodia rutaecarpa alkali were the main active ingredients ofPills, and AKT1, TP53, HSP90AA1 were the main targets. After GO enrichment analysis, a total of 136 items meeting the screening criteria were obtained, involving multiple biological processes such as cytokines involved in receptor, nuclear receptors, regulatory sequence specific DNA binding, and 165 were obtained by KEGG enrichment analysis.Pills can control PI3K-Akt signal pathway, hepatitis B, and IL-17 signal pathway to treat hepatocellular carcinoma. The results are basically consistent through bioinformatics gene chip verification.

    Pills; hepatocellular carcinoma; network pharmacology; pathway

    R273.57;R285.5

    A

    1005-5304(2021)02-0019-09

    10.19879/j.cnki.1005-5304.202001256

    國家自然科學(xué)基金(81873303);湖南省自然科學(xué)基金(2016JJ6113);湖南省衛(wèi)生健康委科研計(jì)劃項(xiàng)目(20200949);湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金(2018ZYX51)

    李菁,E-mail:lilee2711@sina.com

    (收稿日期:2020-01-16)

    (修回日期:2020-02-05;編輯:陳靜)

    猜你喜歡
    金丸吳茱萸藥理學(xué)
    楊云中
    基于藥理學(xué)分析的護(hù)理創(chuàng)新實(shí)踐探索
    說說三個(gè)“金丸”的功效和特點(diǎn)
    藝術(shù)藥理學(xué)
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    大花吳茱萸果實(shí)化學(xué)成分及其生物活性
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:02
    UPLC-Q-TOF-MS法分析吳茱萸化學(xué)成分
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    藥理學(xué)原則在抗微生物藥給藥方案設(shè)計(jì)中的應(yīng)用
    左金丸及其加味藥在消化系統(tǒng)疾病防治中的研究進(jìn)展*
    藥理學(xué)教學(xué)方法的改革初探
    吳茱萸敷腹治療嬰幼兒腹瀉及護(hù)理69例
    熟妇人妻不卡中文字幕| 在线观看国产h片| 99久久人妻综合| 欧美精品国产亚洲| 全区人妻精品视频| 国产日韩欧美在线精品| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 美女主播在线视频| 久久久久国产网址| 免费观看a级毛片全部| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲精品自拍成人| 22中文网久久字幕| 日韩欧美 国产精品| 大香蕉久久网| 女人久久www免费人成看片| 久久久久国产网址| 国产精品.久久久| h日本视频在线播放| 国产欧美亚洲国产| 日韩精品免费视频一区二区三区 | h日本视频在线播放| 久久女婷五月综合色啪小说| 伊人久久精品亚洲午夜| 中文资源天堂在线| 亚洲精品一二三| 久久狼人影院| 国产在线男女| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 精品久久久噜噜| 欧美一级a爱片免费观看看| 99热这里只有是精品50| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产色婷婷99| 男女无遮挡免费网站观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲第一av免费看| 91成人精品电影| 欧美成人午夜免费资源| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久久久国产电影| 亚洲av综合色区一区| 97精品久久久久久久久久精品| 大片免费播放器 马上看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一区二区三区免费毛片| 免费观看的影片在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 丝瓜视频免费看黄片| 免费看日本二区| 超碰97精品在线观看| 亚洲av综合色区一区| 久久久久久人妻| 国产乱人偷精品视频| tube8黄色片| 高清在线视频一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产精品成人久久小说| 少妇熟女欧美另类| 纯流量卡能插随身wifi吗| 老女人水多毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 精品一区二区三卡| 久久久精品免费免费高清| 少妇的逼水好多| 性高湖久久久久久久久免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产熟女欧美一区二区| 91久久精品电影网| 午夜日本视频在线| 中文欧美无线码| 五月伊人婷婷丁香| 欧美bdsm另类| 国产伦精品一区二区三区视频9| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 观看av在线不卡| 国产一区二区在线观看av| 桃花免费在线播放| 亚洲内射少妇av| 校园人妻丝袜中文字幕| 好男人视频免费观看在线| 99久国产av精品国产电影| 性色av一级| 乱码一卡2卡4卡精品| 久久婷婷青草| 欧美人与善性xxx| 国产欧美亚洲国产| 永久网站在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品偷伦视频观看了| 国产 一区精品| 欧美精品一区二区大全| av福利片在线观看| 中文资源天堂在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 偷拍熟女少妇极品色| 午夜福利视频精品| 中文字幕制服av| 少妇的逼好多水| 老司机亚洲免费影院| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产黄片视频在线免费观看| 国产成人a∨麻豆精品| 热99国产精品久久久久久7| 免费看av在线观看网站| 国产在线一区二区三区精| av专区在线播放| 久久鲁丝午夜福利片| 黄色一级大片看看| 22中文网久久字幕| 人人妻人人澡人人看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 蜜桃在线观看..| av天堂中文字幕网| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 女人精品久久久久毛片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 日韩欧美精品免费久久| 下体分泌物呈黄色| 极品教师在线视频| av在线老鸭窝| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩综合久久久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产亚洲5aaaaa淫片| 精品久久久久久电影网| 99九九线精品视频在线观看视频| 美女内射精品一级片tv| 成年人午夜在线观看视频| 丝袜在线中文字幕| av在线老鸭窝| 国产探花极品一区二区| 日本黄大片高清| 26uuu在线亚洲综合色| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲成人手机| 亚洲高清免费不卡视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 日韩视频在线欧美| 久久久久久久久久成人| av.在线天堂| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 视频区图区小说| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 中文字幕av电影在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 国产一区亚洲一区在线观看| 色吧在线观看| 天堂8中文在线网| 国产精品熟女久久久久浪| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 黄色配什么色好看| 免费观看av网站的网址| 亚洲天堂av无毛| √禁漫天堂资源中文www| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 99久久人妻综合| 欧美高清成人免费视频www| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美日韩在线观看h| 亚州av有码| 男男h啪啪无遮挡| 51国产日韩欧美| 内地一区二区视频在线| kizo精华| 亚洲成人av在线免费| 国产精品国产三级专区第一集| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久青草综合色| 五月天丁香电影| av线在线观看网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 老司机影院毛片| 一区在线观看完整版| 一级a做视频免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 在线观看www视频免费| 精品亚洲成国产av| 国产成人精品福利久久| 午夜免费观看性视频| 欧美日本中文国产一区发布| kizo精华| 免费观看av网站的网址| 欧美日韩在线观看h| 成人特级av手机在线观看| 亚洲国产最新在线播放| 色视频www国产| 免费人成在线观看视频色| a级毛片在线看网站| 国产一区二区在线观看日韩| 精品一区在线观看国产| 国产精品嫩草影院av在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 国产在线视频一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 99久久精品热视频| 黄色毛片三级朝国网站 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲精品国产成人久久av| 99久国产av精品国产电影| 精品人妻一区二区三区麻豆| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 69精品国产乱码久久久| 九色成人免费人妻av| 美女cb高潮喷水在线观看| 乱人伦中国视频| 岛国毛片在线播放| 国产一区二区三区av在线| 国产男女内射视频| 99九九在线精品视频 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产视频首页在线观看| 国产精品久久久久成人av| 国产精品久久久久久久久免| 国产伦理片在线播放av一区| 91久久精品电影网| 久久久久视频综合| 99九九在线精品视频 | 免费高清在线观看视频在线观看| 国产精品三级大全| 久久久久网色| 丁香六月天网| 色94色欧美一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产69精品久久久久777片| 日韩一区二区视频免费看| 国产成人精品无人区| 久久久久久久久大av| 插阴视频在线观看视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文资源天堂在线| 国产极品天堂在线| 精品久久久久久久久av| 热99国产精品久久久久久7| 97在线人人人人妻| 国产精品一区二区在线观看99| 看非洲黑人一级黄片| 久久精品久久精品一区二区三区| 99热全是精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 午夜福利网站1000一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 99久久综合免费| 久久久久久人妻| 女人久久www免费人成看片| 黄片无遮挡物在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 99热国产这里只有精品6| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品国产三级国产专区5o| 夜夜爽夜夜爽视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本vs欧美在线观看视频 | kizo精华| 亚洲av国产av综合av卡| 中国国产av一级| 国产美女午夜福利| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av欧美aⅴ国产| xxx大片免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩电影二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品国产成人久久av| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品一二三| 亚洲欧美精品专区久久| 色哟哟·www| 丰满少妇做爰视频| av在线app专区| av福利片在线观看| av免费在线看不卡| 日韩欧美精品免费久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品一区二区性色av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产片特级美女逼逼视频| 国产在线男女| 深夜a级毛片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av在线观看美女高潮| 三级经典国产精品| 久久久久久久久大av| 亚洲va在线va天堂va国产| 日日啪夜夜爽| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 人妻人人澡人人爽人人| 99热这里只有是精品50| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产成人91sexporn| 男人和女人高潮做爰伦理| 在线观看一区二区三区激情| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲欧洲日产国产| 久久精品国产亚洲网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产淫片久久久久久久久| 赤兔流量卡办理| 欧美日韩在线观看h| 男男h啪啪无遮挡| av在线app专区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 2018国产大陆天天弄谢| 麻豆乱淫一区二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 七月丁香在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| 97超碰精品成人国产| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜91福利影院| 国产免费又黄又爽又色| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本av手机在线免费观看| 中文在线观看免费www的网站| 制服丝袜香蕉在线| 黑人猛操日本美女一级片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲av男天堂| 欧美日韩av久久| 免费看光身美女| 视频区图区小说| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 免费观看a级毛片全部| 能在线免费看毛片的网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品无大码| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男女无遮挡免费网站观看| 日日啪夜夜撸| 国产成人免费无遮挡视频| tube8黄色片| 久久久午夜欧美精品| 日日爽夜夜爽网站| 久久精品国产亚洲av天美| 人妻夜夜爽99麻豆av| 成人影院久久| a级毛色黄片| 伦理电影大哥的女人| 成人国产av品久久久| 国产爽快片一区二区三区| 三级国产精品欧美在线观看| 在线观看国产h片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产免费福利视频在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 乱人伦中国视频| 国产精品国产三级专区第一集| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久这里有精品视频免费| 国产精品无大码| 插阴视频在线观看视频| kizo精华| 国产成人91sexporn| 国产乱来视频区| av福利片在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产精品伦人一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 黄色怎么调成土黄色| 三上悠亚av全集在线观看 | 精品国产国语对白av| 18+在线观看网站| www.色视频.com| 久久人人爽人人片av| 久久国产精品大桥未久av | 男人添女人高潮全过程视频| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美日韩av久久| 欧美最新免费一区二区三区| 激情五月婷婷亚洲| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一区二区三区免费毛片| 97超碰精品成人国产| 成人国产麻豆网| 麻豆乱淫一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 免费黄频网站在线观看国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 91精品国产九色| 永久免费av网站大全| 91精品伊人久久大香线蕉| 丝袜喷水一区| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区国产| 成人免费观看视频高清| 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费少妇av软件| 婷婷色综合大香蕉| 51国产日韩欧美| 熟女电影av网| 黄色毛片三级朝国网站 | 少妇的逼好多水| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 男男h啪啪无遮挡| 国产av一区二区精品久久| www.色视频.com| 欧美3d第一页| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 一区二区三区乱码不卡18| 国产精品人妻久久久久久| 色吧在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品aⅴ在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 美女中出高潮动态图| 日本wwww免费看| 免费在线观看成人毛片| 中文字幕人妻丝袜制服| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩成人伦理影院| 777米奇影视久久| 亚洲精品国产av蜜桃| 男女边摸边吃奶| 99九九在线精品视频 | 久久久久久久精品精品| 久久久精品免费免费高清| 七月丁香在线播放| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av日韩在线播放| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在线精品无人区一区二区三| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产乱人偷精品视频| 久久99蜜桃精品久久| 老司机影院成人| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩强制内射视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美日韩av久久| 在线天堂最新版资源| 亚洲色图综合在线观看| 在线播放无遮挡| 久久久久视频综合| 久久精品国产亚洲av天美| 少妇被粗大猛烈的视频| 简卡轻食公司| 老司机影院毛片| a级毛片免费高清观看在线播放| av在线app专区| 最黄视频免费看| 国产视频内射| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲四区av| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国精品久久久久久国模美| 中国美白少妇内射xxxbb| 有码 亚洲区| 观看免费一级毛片| 国内揄拍国产精品人妻在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 春色校园在线视频观看| 免费av不卡在线播放| 免费观看无遮挡的男女| 不卡视频在线观看欧美| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩大片免费观看网站| 中文字幕免费在线视频6| 日本午夜av视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国内精品宾馆在线| 黑丝袜美女国产一区| 高清不卡的av网站| 99re6热这里在线精品视频| av天堂久久9| 午夜视频国产福利| 精品久久国产蜜桃| 日韩电影二区| 精品午夜福利在线看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产 一区精品| 人妻系列 视频| 日韩人妻高清精品专区| 高清欧美精品videossex| 亚洲成人av在线免费| 高清不卡的av网站| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人黄色视频免费在线看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩亚洲欧美综合| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 亚洲av免费高清在线观看| 在线天堂最新版资源| 欧美日韩国产mv在线观看视频| av福利片在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 99国产精品免费福利视频| 青青草视频在线视频观看| 久久久欧美国产精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 国产亚洲最大av| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩av免费高清视频| 欧美97在线视频| 亚州av有码| 99热这里只有是精品50| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丝袜喷水一区| 一本色道久久久久久精品综合| 新久久久久国产一级毛片| 色婷婷av一区二区三区视频| 日日啪夜夜爽| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 91成人精品电影| www.色视频.com| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线观看人妻少妇| 一级毛片 在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 99热网站在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚州av有码| 中文字幕久久专区| 亚洲内射少妇av| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲欧洲日产国产| 少妇的逼水好多| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久影院123| 99国产精品免费福利视频| 天堂8中文在线网| 精品酒店卫生间| 热re99久久国产66热| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美精品亚洲一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 色视频www国产| 深夜a级毛片| 中文字幕免费在线视频6| 日本wwww免费看| 久久久久久人妻| 亚洲综合色惰| 国产日韩欧美在线精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国国产精品蜜臀av免费| 97超碰精品成人国产| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品.久久久| 午夜老司机福利剧场| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 91精品国产九色| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美97在线视频| 国产亚洲最大av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 综合色丁香网| 另类亚洲欧美激情| 久久人人爽人人爽人人片va| 日本91视频免费播放| 午夜激情久久久久久久| 又爽又黄a免费视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲不卡免费看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久婷婷青草| 九色成人免费人妻av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 免费观看性生交大片5| 春色校园在线视频观看| 永久网站在线| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品国产三级专区第一集| 18禁动态无遮挡网站| 美女国产视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品国产成人久久av| 十八禁网站网址无遮挡 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 国产一级毛片在线| 婷婷色综合大香蕉| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产欧美在线一区| kizo精华|