乙型肝炎患者血清絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1表達(dá)與病毒載量的相關(guān)性分析

劉宏偉 王玉華

1.河北省滄州市傳染病醫(yī)院肝病科 (河北 滄州， 061001) 2.河北省滄州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

乙型肝炎病毒(HBV)感染屬于全球傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。HBV持續(xù)感染則會(huì)導(dǎo)致肝硬化，此外細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制所造成的病理?yè)p傷也是引發(fā)肝硬化的重要分子機(jī)制，乙型肝炎患者血清中HBV DNA載量能夠反映患者病毒感染程度[2,3]。絲氨酸肽酶抑制因子 Kazal 1 型(SPINK1)屬于炎性蛋白，主要分布于肝臟。Lamontagne等[4]研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者組織中及乙型肝炎病毒攜帶者血清中SPINK1表達(dá)水平明顯升高，推測(cè)其可能參與肝癌的發(fā)展過(guò)程。本研究分析SPINK1水平與乙型肝炎患者HBV DNA載量的關(guān)系，為乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年4月至2019年4月在河北省滄州市傳染病醫(yī)院接受治療的157例乙型肝炎患者資料，其中男99例，女58例；年齡23～69歲，平均(47.36±11.32)歲。另選取近期在該院體檢的126例健康者作為對(duì)照組，男82例，女44例；年齡22～68歲，平均(45.51±12.27)歲。兩組受試者性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有乙型肝炎患者均符合 《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②對(duì)照組人群肝功能正常；③年齡<70歲；④所有受試者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并自身免疫疾病者；②酒精等其他因素導(dǎo)致的肝炎患者；③未接受抗病毒相關(guān)治療者；④近期服用降酶藥物或免疫抑制劑者；⑤復(fù)合病毒感染者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 入院時(shí)收集所有受試者空腹外周血5 ml，加入抗凝劑后，3 000g離心20 min分離血清，在-80℃中凍存。

1.3.2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司，貨號(hào):15596018。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司，貨號(hào)：K1622。qPCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)于艾美捷科技有限公司，貨號(hào)P-1029-100。DNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega公司，貨號(hào)：M6229-01。HBV DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于ROCHE公司，貨號(hào)11585614910。人HBsAg酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海恒斐生物科技有限公司，貨號(hào):CSB-E10089h-1?？笻Bs ELISA試劑盒購(gòu)于上海羽朵生物科技有限公司，貨號(hào):YDBA042。 HBeAg ELISA試劑盒購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司 ，貨號(hào):EH4105。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海晶抗生物工程有限公司，貨號(hào)分別為3185、2349、108226、14867。7500 PCR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司。酶標(biāo)儀購(gòu)于北京安麥格貿(mào)易有限公司。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)血清中SPINK1 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑提取血清總RNA，根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，SPINK1 引物序列:上游:5′-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3′，下游:5′- AGTATTTCCATCAGTCCC -3′；GADPH引物序列：GAPDH上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCAGTCA-3′; 下游引物:5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′。20 μl擴(kuò)增體系：10 μl SYBR Mastermix ，上下游引物分別0.5 μl、2 μl cDNA，ddH2O 7 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)定3個(gè)重復(fù)，結(jié)束后將GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCq算法定量評(píng)估SPINK1相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 RT-PCR法檢測(cè)血清HBV-DNA載量 參考DNA提取試劑盒說(shuō)明提取血清DNA，配制40 μl擴(kuò)增體系： 20 μl PCR Mix，2 μl 引物混合物，DNA樣品2 μl(樣品/陰性質(zhì)控品/陽(yáng)性質(zhì)控品)，ddH2O 16 μl?；靹蚝?，程序參數(shù)設(shè)置為93℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；93℃ 45 s ，55℃ 1 min，10個(gè)循環(huán)；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)，于55℃ 45 s時(shí)采集熒光。

1.3.5 血清抗原標(biāo)志物、肝功能檢測(cè) 采用ELISA法對(duì)所有受試者血清中HBsAg、抗HBs、HBeAg、ALT、AST、TBil、DBil水平，具體參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清SPINK1表達(dá)水平 乙型肝炎組患者血清中SPINK1 mRNA水平為1.78±0.26，與對(duì)照組(1.05±0.12)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 乙型肝炎患者血清SPINK1表達(dá)與HBV DNA載量的關(guān)系 乙型肝炎患者血清HBV DNA載量為(5.34,12.45)log10 copies/ml，中位值為7.81 log10 copies/ml。以HBV DNA病毒載量<7.81 log10 copies/ml為低載量組，以HBV DNA病毒載量>7.81 log10 copies/ml為高載量組。高載量組患者血清中SPINK1 mRNA表達(dá)為2.06±0.33，與低載量組(1.57±0.46)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 血清抗原標(biāo)志物與HBV DNA載量的關(guān)系 與低載量組比較，高載量組患者血清HBsAg、HBeAg水平明顯升高，HBcAb水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同HBV DNA載量組患者HBsAg、HBeAg、HBcAb水平比較

2.4 乙型肝炎患者肝功能指標(biāo)與HBV DNA載量的關(guān)系 與低載量組比較，高載量組患者血清ALT水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者AST、TBil、DBil水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同HBV DNA載量組ALT、AST、TBil、DBil水平比較

2.5 影響乙型肝炎患者HBV DNA載量的Logistic回歸分析 以乙型肝炎患者HBV DNA載量作為因變量，HBsAg、HBcAb、HBeAg、ALT、SPINK1作為自變量納入Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，HBeAg(OR=1.586，95%CI=1.028～2.446)、ALT(OR=1.965，95%CI=1.307～2.954)、SPINK1(OR=1.842，95%CI=1.167～2.908)是乙型肝炎患者HBV DNA載量危險(xiǎn)影響因素。見表3。

表3 影響乙型肝炎患者HBV DNA載量的因素

2.6 SPINK1與HBV DNA載量、血清抗原標(biāo)志物、肝功能相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，SPINK1與HBV DNA載量、HBeAg、ALT呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.426，r=0.408，r=0.395，均P<0.05)。見圖1。

圖1 SPINK1與HBV DNA載量、HbeAg、ALT相關(guān)性

3 討論

乙型肝炎的病理機(jī)制是HBV進(jìn)入體內(nèi)后不斷復(fù)制，引起病毒血癥，同時(shí)HBV復(fù)制可干擾肝細(xì)胞內(nèi)大分子的合成，降低溶酶體膜通透性降低，引發(fā)肝臟病變[6]。HBV感染初期患者一般無(wú)明顯特征，少部分患者會(huì)自發(fā)清除病毒，但多數(shù)患者HBV感染是持續(xù)性的，可進(jìn)一步發(fā)展為慢性乙型肝炎，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不⒏伟?。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎表面抗原、炎癥因子、白細(xì)胞介素等均與HBV感染相關(guān)，可能影響肝臟功能，進(jìn)而影響HBV感染的不同結(jié)局，深入探究影響HBV DNA載量的分子機(jī)制，對(duì)于揭示肝炎、肝癌的發(fā)生機(jī)制具有重要的意義[7,8]。

SPINK1屬于胰蛋白酶抑制劑，定位在染色體5q32位置，其水平的異常表達(dá)與腫瘤的異常發(fā)生相關(guān)[9]。Faisal等[10]研究發(fā)現(xiàn)在前列腺患者組織中SPINK表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與腫瘤浸潤(rùn)程度、患者預(yù)后無(wú)明顯關(guān)系。Xu等[11]研究發(fā)現(xiàn)SPINK1能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移，其機(jī)制可能與上調(diào)基質(zhì)金屬酶12表達(dá)有關(guān)，預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)SPINK1高表達(dá)是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。Shek等[12]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)SPINK1在人肝癌中高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)spink1通過(guò)激活c-raf/mek/erk途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。王偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中SPINK1表達(dá)明顯升高，對(duì)肝癌具有較高的診斷效能，高水平SPINK1表達(dá)者生存期明顯低于低水平表達(dá)者。目前HBV對(duì)SPINK1的作用研究不多，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血清中SPINK1表達(dá)顯著升高，體外研究發(fā)現(xiàn)HCV可上調(diào)肝癌細(xì)胞中SPINK1表達(dá)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎患者血清中SPINK1表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)隨著HBV DNA載量的增加，乙型肝炎血清中SPINK1表達(dá)進(jìn)一步升高，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)，提示SPINK1可能參與乙肝病毒感染過(guò)程，與感染程度有關(guān)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)SPINK1是影響患者HBV DNA載量的危險(xiǎn)因素，提示高水平SPINK1可能會(huì)增加HBV感染風(fēng)險(xiǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)HBsAg主要用于HBV感染初期篩查和診斷，可用于病毒治療效果評(píng)定[15]。HBeAg陽(yáng)性可作為HBV復(fù)制的標(biāo)志 ，其水平的升高代表傳染性、致病性較強(qiáng)， 當(dāng) HBeAg水平降低，則表明HBV復(fù)制減少，病情相對(duì)穩(wěn)定[16]。本研究發(fā)現(xiàn)高載量組患者血清HBsAg、HBeAg水平明顯升高，HBcAb水平明顯降低，說(shuō)明隨著病毒復(fù)制增多，血清HBsAg、HBeAg水平升高，HBcAb水平降低，三者與HBV感染程度相關(guān)。Logistic分析發(fā)現(xiàn)HBeAg是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說(shuō)明HBsAg、HBcAb水平的變化可能不能直接反映HBV DNA載量情況，而病毒處于復(fù)制狀態(tài)時(shí)，HBV DNA載量處于較高水平，提示HBeAg水平可反映患者HBV DNA載量。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)HBeAg是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說(shuō)明高水平的HBeAg會(huì)進(jìn)一步影響患者HBV DNA載量。SPINK1、HBeAg均與患者HBV DNA載量相關(guān)，進(jìn)一步采用Pearson相關(guān)性分析兩者間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明二者可能存在某種相互作用共同參與患者HBV的復(fù)制，具體機(jī)制尚不明確。

HBV DNA載量是否與肝臟損傷有關(guān)，觀點(diǎn)不一，相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血清HBV DNA定量與肝臟炎癥因子及功能指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)性[17]；有學(xué)者研究認(rèn)為 HBV DNA載量升高會(huì)進(jìn)一步加重肝臟炎癥損傷，加重感染程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著HBV DNA載量的升高，肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT水平升高，表明隨著病毒載量的升高，肝臟受損程度加重，提示病毒復(fù)制可能會(huì)影響肝功能。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)ALT是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說(shuō)明肝功能受損后會(huì)進(jìn)一步影響患者HBV DNA載量。SPINK1、ALT均與患者HBV DNA載量相關(guān)，采用Pearson相關(guān)性分析SPINK1、ALT間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著正相關(guān)，推測(cè)SPINK1上調(diào)后會(huì)加速病毒復(fù)制，進(jìn)一步損傷肝功能，影響ALT水平。