頂空氣相色譜法測定奧貝膽酸原料藥中有機溶劑的殘留量

付丙月，吳偉山，張 寧，王金虎*

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室， 山東 濟南 250101；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 濟南 250101）

奧貝膽酸（obeticholic acid，OCA），商品名Ocaliva，通過活化法尼醇X受體，間接抑制細胞色素7A1（CYP7A1）的基因表達，是一種法尼醇X受體特異性激動劑，由Intercept公司研發(fā)，美國FDA于2016年5月27日有條件加速批準其用于治療原發(fā)性膽汁性膽管炎，是近20年首個獲得美國FDA批準治療原發(fā)性膽汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病的藥物[1-5]。目前，尚未見奧貝膽酸原料藥中有機溶劑殘留量測定的文獻報道。本文針對其合成反應(yīng)中使用的甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯等有機溶劑進行檢測[6-13]。根據(jù)ICH和《中國藥典》2015年版（四部）附錄0861的相關(guān)規(guī)定，采用氣相色譜法（GC）頂空進樣方式，對奧貝膽酸原料藥中10種有機溶劑的殘留量進行同時測定，以確保藥品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性[14-16]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B型氣相色譜儀，包括氫火焰離子化檢測器（FID）、7697E型頂空進樣器（美國安捷倫）；XS-205型電子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥

奧貝膽酸原料藥（批號：20160310，純度：99.9 %；批號：20160315，純度：99.8 %；批號：20160321，純度：99.9 %；批號：20160329，純度：99.9 %；批號：20160401，純度：99.9 %；批號：20160414，純度：99.9 %；批號：20160429，純度：99.9 %；批號：20160511，純度：99.8 %；批號：20160523，純度：99.9 %），本研究院根據(jù)不同合成路線自制[6-13]；N,N-二甲基甲酰胺（分析純），甲醇（色譜純），正己烷（分析純），乙腈（色譜純，天津康科德）；甲苯（分析純），乙酸乙酯（分析純），二氯甲烷（分析純，國藥集團）；四氫呋喃（分析純），三乙胺（分析純，天津富宇）；無水乙醇（分析純，天津科密歐）；異丙醇（分析純，山東禹王和天下新材料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624毛細管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持6 min，以30 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持8 min；檢測器溫度：220 ℃；進樣口溫度：220 ℃；載氣：氮氣，流速3.0 ml/min；分流比：5:1；進樣方式：頂空進樣；進樣瓶體積為10 ml；頂空平衡溫度：85 ℃；平衡時間：30 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱量甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯，置入100 ml量瓶，加入N,N-二甲基甲酰胺并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為300，500，500，41，60，29，500，72，500，89 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取奧貝膽酸50 mg，置入10 ml頂空瓶，加入5 ml N,N-二甲基甲酰胺，密封，輕輕搖勻，即得。

2.2.3 空白溶劑對照 精密量取5 ml N,N-二甲基甲酰胺，置入10 ml頂空瓶，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

按2.1項下色譜條件，取空白溶劑和混合對照品溶液分別進樣，記錄色譜圖。由色譜圖可見，對照品溶液中各待測溶劑出峰順序依次為：甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯，空白溶劑N,N-二甲基甲酰胺對測定無影響，混合對照品中各組分分離度良好，R值均大于2，詳見圖1～3。

圖1 空白溶劑氣相色譜圖

圖2 系統(tǒng)適用性氣相色譜圖

圖3 奧貝膽酸樣品（批號：20160523）氣相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取2.2.1項下的混合對照品儲備液各0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25 ml，置入25 ml量瓶，加N,N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，制成一系列不同濃度的線性混合對照品溶液。精密量取線性混合對照品溶液5 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。根據(jù)2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以對照品溶液中各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

2.5 定量限與檢出限考察

精密量取2.4項下對照品溶液（2 ml→25 ml），N,N-二甲基甲酰胺稀釋后，按2.1項下色譜條件進樣測定。按信噪比（S/N）10:1考察定量限，結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯的定量限分別為6.04，10.02，10.13，0.81，1.22，0.55，10.16，1.45，10.09，1.79 μg/ml。按S/N=3:1考察檢測限，結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯的定量限分別為2.01，3.35，3.37，0.27，0.41，0.18，3.38，0.48，3.36，0.60 μg/ml。

2.6 精密度試驗

精密量取2.2.1項下的混合對照品溶液5 ml，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯峰面積的RSD分別為2.01 %，1.26 %，1.89 %，2.20 %，2.31 %，1.74 %，1.18 %，2.63 %，2.53 %，1.90 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取2.2.2項下供試品溶液（批號：20160523）5 ml，置入10 ml量瓶，加入2.2.1項下混合對照品溶液1 ml，加入N,N-二甲基甲酰胺定容，搖勻，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯峰面積的RSD分別為1.07 %，1.30 %，0.97 %，1.65 %，1.74 %，1.03 %，0.96 %，1.73 %，1.98 %，1.18 %（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取原料藥樣品（批號：20160523）適量，共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品殘留量。結(jié)果甲醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯峰面積均未檢出，乙醇的殘留量平均值為0.02 %，RSD為1.75 %（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知殘留量原料藥樣品（批號：20160523）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的各待測成分對照品溶液適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲苯的加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.10 奧貝膽酸樣品中殘留溶劑含量測定

取9批奧貝膽酸原料藥樣品各適量，按2.2.2項下方法處理后，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，以外標法計算甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺、甲苯10種殘留溶劑含量，結(jié)果表3。

表3 樣品中殘留溶劑量測定結(jié)果（n=3，%）

3 討論

3.1 待檢測樣品的選擇

經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，奧貝膽酸的合成路線較多，本院為篩選出更優(yōu)的適宜工業(yè)化生產(chǎn)的合成路線，對報道的各合成路線均進行試驗，并得到合格的產(chǎn)品。因此，實驗中選用本單位根據(jù)不同合成方法自制的9批樣品。

3.2 進樣方式的選擇

本試驗各待測殘留溶劑均為低沸點溶劑，與直接進樣方式相比，該方法干凈、快速，不會分解出揮發(fā)性產(chǎn)物干擾試驗結(jié)果，故采用頂空進樣。

3.3 色譜柱的選擇

本研究考察了HP-5、AT-5、DB-WAX和DB-624不同極性的毛細管色譜柱，發(fā)現(xiàn)采用DB-624毛細管柱進行測定時，各待測有機溶劑峰之間的分離效果最好，峰形尖銳且對稱，靈敏度高，故選擇DB-624毛細管色譜柱。

3.4 溶劑的選擇

試驗中，考察了水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N,N-二甲基乙酰胺作為溶劑，發(fā)現(xiàn)奧貝膽酸在水中溶解度較差，在二甲亞砜、N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解。以上述3種溶劑分別配制對照溶液，連續(xù)進樣，發(fā)現(xiàn)待測有機溶劑在N,N-二甲基甲酰胺前出峰，穩(wěn)定性更好，對待測溶劑無干擾，故選擇N,N-二甲基甲酰胺作為實驗溶劑。

綜上，本方法操作簡單，準確可靠，為奧貝膽酸原料藥的質(zhì)量控制提供了一種有效手段，適用于奧貝膽酸原料藥中甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、三乙胺和甲苯殘留量的測定。