基于血清miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的胰腺癌診斷決策樹(shù)構(gòu)建

張帆，李澤東，彭禹，陳勝，周鈞

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.湖南省湘西自治州人民醫(yī)院 普外一科，湖南 吉首416000）

胰腺癌是第七常見(jiàn)的惡性腫瘤，在中國(guó)，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第六位因素[1]。其5年生存率僅有5%～10%，在確診胰腺癌后，患者的中位生存時(shí)間約為5～6個(gè)月[2-3]。實(shí)際上，絕大多數(shù)胰腺癌患者都出現(xiàn)了局部進(jìn)展，甚至是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（80%～85%），只有極少數(shù)患者是可以手術(shù)切除的（15%～20%）[4-5]。胰腺癌的不良預(yù)后原因眾多，例如，系統(tǒng)免疫炎癥指數(shù)可能是胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]，早期階段的檢測(cè)率低，具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)，以及化療的效果較差等[7]，手術(shù)僅在診斷為早期胰腺癌的15%～20%的患者中被認(rèn)為是可行的[8]，由于胰腺癌患者往往到了晚期，才開(kāi)始出現(xiàn)少量癥狀，因而，開(kāi)發(fā)能夠早期診斷胰腺癌的工具是有重大意義的[9]。血清碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是目前用作評(píng)估胰腺癌臨床治療療效的標(biāo)志物，盡管它低靈敏度和低特異性，但它仍然是胰腺癌中唯一獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的標(biāo)志物，其他抗原（例如CEA和CA125）作為早期標(biāo)記完全無(wú)效，但一些腫瘤學(xué)家仍將其用作治療反應(yīng)性的標(biāo)記[10]。因此，尋找更為有效的胰腺癌診斷分子標(biāo)志物，依舊是個(gè)值得深入探討的課題。

microRNA（miRNA）是長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，發(fā)揮著調(diào)控基因表達(dá)和RNA沉默中的功能。異常的miRNA在多種腫瘤及良性疾病中被發(fā)現(xiàn)，并且發(fā)揮著重要的作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)，許多miRNA可以在血漿、血清等體液中穩(wěn)定存在，這也使得研究循環(huán)miRNA以檢測(cè)疾病的進(jìn)展成為可能[12-13]。由于miRNA可以在體液（例如血清或血漿）中檢測(cè)到，因此它們已成為潛在的有用的生物標(biāo)志物，用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，診斷和預(yù)后[14]。例如，Martínez-Hernández等[15]的研究發(fā)現(xiàn)血清miR-19b和miR-26b可能用于預(yù)測(cè)免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病的發(fā)生，Huang等[16]發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的miR-487a，miR-493-5p，miR-501-3p和miR-502-5p是骨肉瘤的新型潛在診斷生物標(biāo)志物。可見(jiàn)，血清miRNA作為預(yù)測(cè)疾病的生物標(biāo)志物的巨大潛力。

決策樹(shù)是一種用于判別分析的監(jiān)督式機(jī)器學(xué)習(xí)算法，它易于理解和解釋。它允許通過(guò)以分層樹(shù)或規(guī)則集的形式生成可理解的知識(shí)結(jié)構(gòu)并以圖形直觀的方式呈現(xiàn)它們，從而從數(shù)據(jù)中提取知識(shí)[17]。決策樹(shù)也已用于鑒定癌癥中的生物標(biāo)志物，例如，利用miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行肺癌診斷和亞型分型[18]，使用核受體表達(dá)定義一組肺癌的預(yù)后生物標(biāo)志物[19]等。本研究旨在通過(guò)分析GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫(kù)中血清miRNA的測(cè)序數(shù)據(jù)，將決策樹(shù)的方法應(yīng)用于胰腺癌的預(yù)測(cè)中，確定胰腺癌的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

這項(xiàng)研究中我們比較了來(lái)自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的胰腺癌患者和健康對(duì)照人群的血清miRNA表達(dá)譜。其中納入研究的數(shù)據(jù)集包括：GSE113486，包含40例胰腺癌患者血清miRNA樣本，和100例非腫瘤對(duì)照樣本；GSE85589包含19例健康對(duì)照和88例胰腺癌患者血清樣本。GEOquery R包用于下載臨床信息及表達(dá)譜。

1.2 去除批次效應(yīng)

由于本研究下載的表達(dá)譜數(shù)據(jù)是經(jīng)過(guò)預(yù)先處理及標(biāo)準(zhǔn)化的，這里無(wú)需進(jìn)一步處理，但由于GSE113486及GSE85589非同批次測(cè)序結(jié)果，這里需要進(jìn)一步去除批次效應(yīng)，以利進(jìn)一步研究。批次效應(yīng)是指表示測(cè)序樣本在不同的批次處理和測(cè)量時(shí)引入的與生物狀態(tài)不相關(guān)的系統(tǒng)性的技術(shù)偏差。本研究采用sva R包的ComBat函數(shù)移除批次效應(yīng)，并使用主成分分析（principal component analysis，PCA）評(píng)估批次效應(yīng)移除前后的差異。

1.3 關(guān)鍵miRNA 的初步篩選

LASSO（least absolute shrinkage and selection operator）回歸是擬合高維廣義線性模型的一種流行的變量選擇方法，通過(guò)構(gòu)造懲罰函數(shù)以減少變量數(shù)并有效避免過(guò)度擬合，可以得到更精細(xì)的模型。為了篩選出用于鑒別腫瘤與非腫瘤樣本的關(guān)鍵miRNA，本研究通過(guò)R軟件中的glmnet軟件包，使用LASSO回歸分析篩選重要的miRNA。

1.4 決策樹(shù)的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

R語(yǔ)言中的set.seed函數(shù)及sample函數(shù)可用于生成隨機(jī)數(shù)并用于隨機(jī)抽樣分組，本研究基于以上兩個(gè)函數(shù)，通過(guò)隨機(jī)抽樣，將247例樣本，隨機(jī)分為訓(xùn)練集（60%）和測(cè)試集（40%），LASSO回歸分析篩選的關(guān)鍵miRNA用于訓(xùn)練集中決策樹(shù)的構(gòu)建。本研究使用rpart R包實(shí)現(xiàn)決策樹(shù)算法，rpart函數(shù)用于決策樹(shù)的生成，選擇交叉驗(yàn)證誤差最小的樹(shù)即最優(yōu)的樹(shù)。predict函數(shù)用于測(cè)試集中觀測(cè)點(diǎn)的分類，使用ROC曲線分析評(píng)價(jià)決策樹(shù)的預(yù)測(cè)效果，InformationValue R包的plotROC函數(shù)用于ROC曲線繪制。

1.5 關(guān)鍵miRNA 的組間差異

為了對(duì)比正常血清樣本和胰腺癌血清樣本中關(guān)鍵miRNA的表達(dá)差異，本研究利用Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)比了關(guān)鍵miRNA分別在GSE113486 及GSE85589數(shù)據(jù)集中正常與腫瘤樣本的表達(dá)差異，以及在全部樣本中正常與腫瘤樣本的表達(dá)差異。

1.6 關(guān)鍵miRNA 的功能注釋

為進(jìn)一步了解關(guān)鍵miRNA所涉及的功能，本研究利用miRDB、miRTarBsae及TargetScan3種數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miRNA的靶向mRNA。其中，在3 種數(shù)據(jù)庫(kù)中均有預(yù)測(cè)到的靶向mRNA將被用于富集分析，注釋關(guān)鍵miRNA可能涉及的功能，clusterProfiler R包用于富集分析（enrichment analysis）[20]。

2 結(jié)果

2.1 去除批次效應(yīng)

去除批次效應(yīng)前，首先利用主成分分析評(píng)估兩數(shù)據(jù)集之前的批次效應(yīng)，分析結(jié)果如圖1 A所示，兩數(shù)據(jù)集呈現(xiàn)分別聚類，差異明顯。經(jīng)過(guò)ComBat函數(shù)移除批次效應(yīng)后的主成分分析結(jié)果如圖1B，兩數(shù)據(jù)集之間表達(dá)量沒(méi)有出現(xiàn)分別聚類。

圖1 PCA 圖 A：批次效應(yīng)校正前PCA；B：批次效應(yīng)校正后PCAFigure 1 PCA plots A:PCA before batch effect adjustment;B:PCA after batch effect adjustment

2.2 關(guān)鍵miRNA 的篩選

去除批次效應(yīng)后，納入研究的有247例樣本（119例健康對(duì)照和128例胰腺癌），共2526個(gè)miRNA。對(duì)2526個(gè)miRNA進(jìn)行LASSO回歸分析，采用10倍交叉驗(yàn)證，結(jié)果顯示最佳的λ=0.0272212（圖2），其對(duì)應(yīng)變量為33，即33個(gè)miRNA具有鑒別腫瘤樣本及正常樣本的潛力。

圖2 關(guān)鍵miRNA 的篩選 A：LASSO 篩選變量動(dòng)態(tài)過(guò)程圖；B：交叉驗(yàn)證參數(shù)λ 的選擇過(guò)程圖Figure 2 Screening process of the hub miRNAs A:Dynamic process variable screening by LASSO;B:Dynamic process of selection of cross validation parameter λ

2.3 決策樹(shù)的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

為了通過(guò)血清miRNA中關(guān)鍵miRNA表達(dá)區(qū)分腫瘤與正常患者，本研究納入LASSO回歸篩選出的33個(gè)關(guān)鍵miRNA，構(gòu)建決策樹(shù)并驗(yàn)證決策樹(shù)的預(yù)測(cè)效果。研究中將247例樣本按6:4的比例進(jìn)行隨機(jī)分組，分為訓(xùn)練集（71例正常，77例腫瘤）和測(cè)試集（48例正常，51例腫瘤）。將rpart算法應(yīng)用于訓(xùn)練集，獲得了一個(gè)簡(jiǎn)單的決策樹(shù)模型，模型包含兩個(gè)miRNA，分別是miR-4532和miR-4668-5p（圖3）。

圖3 決策樹(shù)模型Figure 3 The decision tree model

使用測(cè)試數(shù)據(jù)集（占總數(shù)據(jù)的40%）來(lái)測(cè)量分類樹(shù)的性能。然后通過(guò)曲線下的面積來(lái)評(píng)價(jià)該分類器的判別力。結(jié)果如圖4，在訓(xùn)練集中ROC曲線下面積（AUC）為0.9481，測(cè)試集中AUC為0.9024。即由miR-4532和miR-4668-5p構(gòu)成的決策樹(shù)在訓(xùn)練集及測(cè)試集中均表現(xiàn)出良好的區(qū)分腫瘤與正常樣本的能力。

2.4 關(guān)鍵miRNA 的組間差異

通過(guò)W i l c o x o n 檢驗(yàn)對(duì)比了關(guān)鍵miRNA在胰腺癌血清樣本和正常血清樣本中的差異，結(jié)果表明，兩組樣本差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）（圖5）。

圖5 關(guān)鍵miRNA 胰腺癌血清樣本和正常血清樣本中差異Figure 5 Differences of the hub miRNAs in pancreatic and normal serum samples

2.5 富集分析

利用3 種數(shù)據(jù)庫(kù)分別預(yù)測(cè)m i R-4532 和miR-4668-5p的靶向mRNA，結(jié)果顯示，miR-4532在3種數(shù)據(jù)庫(kù)中均預(yù)測(cè)到的mRNA有6個(gè)，miR-4668-5p在3種數(shù)據(jù)庫(kù)中均預(yù)測(cè)到的mRNA有73個(gè)。利用clusterProfiler R包進(jìn)行GO（Gene Ontology）富集分析，及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集。GO富集主要包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）。結(jié)果如圖6所示，關(guān)鍵miRNA的靶基因可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，核染色質(zhì)，轉(zhuǎn)錄阻遏物復(fù)合體，巨核細(xì)胞分化的調(diào)控，黏著劑組裝，細(xì)胞-底物連接組織，巨核細(xì)胞分化，黏著斑組裝的負(fù)調(diào)節(jié)等功能有關(guān)。其KEGG結(jié)果表明，關(guān)鍵miRNA的靶基因主要富集于癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，F(xiàn)oxO信號(hào)通路，黏附連接，胰腺癌，乙型肝炎，肝細(xì)胞癌，TGF-β信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路等信號(hào)通路中。

圖6 GO 及KEGG 分析Figure 6 GO and KEGG enrichment analysis

3 討論

miRNA參與了發(fā)育和各種生理過(guò)程，其失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致多種疾病的進(jìn)展[21]。有研究表明，miRNA可以反映病理過(guò)程，因而被認(rèn)為可以用于診斷及鑒別不同的腫瘤類型，甚至是良性疾病的識(shí)別。例如，血清miRNA對(duì)用于高度準(zhǔn)確和特異性地篩查肉瘤[22]，Zou等[23]研究發(fā)現(xiàn)5 種血清miRNA可用作為鼻咽癌的潛在生物標(biāo)志物，Zarecki等[24]發(fā)現(xiàn)血清miRNA作為骨質(zhì)疏松性椎體骨折的新型生物標(biāo)志物等。

使用來(lái)自健康個(gè)體，胰腺癌和胰腺炎患者的胰腺組織的活檢樣品進(jìn)行的比較miRNA表達(dá)譜差異的研究，清楚地表明了與正常細(xì)胞相比，各種miRNA在癌細(xì)胞中的差異表達(dá)，預(yù)示了miRNA在胰腺癌診斷，預(yù)后和抗癌治療中的潛在作用[25]。Hong等[26]研究發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中共發(fā)現(xiàn)了158個(gè)miRNA差異表達(dá)，例如miR-200，miR-96和miR-217。在胰腺癌患者中，除了胰腺細(xì)胞和組織中miRNA的異常表達(dá)外，在全身循環(huán)中也觀察到miRNA失調(diào)。例如，一些研究報(bào)告了miR-18a，miR-21，miR-22，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-155，miR-185，miR-191，miR-196a在胰腺癌血液中的差異表達(dá)[27]，miR-486-5p通過(guò)作用于體內(nèi)多種信號(hào)通路參與胰腺腺癌的發(fā)生發(fā)展[28]，胰腺癌細(xì)胞中miR-519d減低，且對(duì)于胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力有所增強(qiáng)[29]。

在本研究中，通過(guò)LASSO回歸發(fā)現(xiàn)了33個(gè)具有鑒定胰腺癌腫瘤潛力的血清miRNA，并通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建了決策樹(shù)，用于區(qū)分胰腺癌腫瘤患者和正常對(duì)照，其中miR-4532和miR-4668-5p這兩個(gè)血清miRNA被認(rèn)為是有效觀測(cè)點(diǎn)。同樣的，在本研究的訓(xùn)練集和測(cè)試集中，該決策樹(shù)表現(xiàn)出了良好的預(yù)測(cè)效果，即AUC值分別為0.9481和0.9024，miR-4532和miR-4668-5p在腫瘤和正常樣本中也表現(xiàn)出了明顯差異，即腫瘤樣本血清中表達(dá)相對(duì)較高。實(shí)際上，已經(jīng)有研究表明hsamiR-4532在腫瘤中發(fā)揮重要作用，hsa-miR-4532下調(diào)癌癥中的高甲基化可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中的阿霉素抗性[30]，攜帶hsa-miR-4532的急性髓樣白血病細(xì)胞衍生的外泌體可以通過(guò)激活LDOC1依賴性STAT3信號(hào)通路抑制正常的造血干細(xì)胞的造血作用等[31]。也有研究表明miR-4668-3p參與結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[32]，miR-4668-5p在預(yù)測(cè)舒尼替尼治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌反應(yīng)方面具有預(yù)測(cè)潛力[33]。

決策樹(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用已經(jīng)頗為廣泛，例如，用于肝癌肝切除手術(shù)方式選擇的決策樹(shù)[34]，基于MRI的決策樹(shù)用于黃疸型嬰兒的膽道閉鎖診斷中[35]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展和二代測(cè)序的成本降低，越來(lái)越多的測(cè)序可供我們進(jìn)一步研究，將基因組學(xué)數(shù)據(jù)和決策樹(shù)結(jié)合起來(lái)，將是一個(gè)很好的思路，用于癌癥研究。Sherafatian等[18]基于數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建決策樹(shù)進(jìn)行肺癌診斷和亞型分型。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4532和miR-4668-5p在胰腺癌患者的血清中相對(duì)表達(dá)較高，并通過(guò)構(gòu)建決策樹(shù)，用于區(qū)分正常血清樣本和胰腺癌患者血清樣本。這將有益于胰腺癌患者的早期診斷，甚至有可能通過(guò)進(jìn)一步研究，取代傳統(tǒng)的診斷方法，為胰腺癌的診斷提供一個(gè)簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的策略。同時(shí)，miR-4532和miR-4668-5p的預(yù)測(cè)作用也顯示出了其在胰腺癌進(jìn)程中的重要作用，有可能作為潛在的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。