Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系的表達(dá)與定位

王守法，趙淑琴，劉彩萍，張彩霞，韓 樂，祝莉萍，汪瑞龍

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，甘肅蘭州 730070）

已有研究表明，Cry1 蛋白在人和小鼠的垂體、肝臟、性腺等組織中廣泛表達(dá)[8]。羅萬偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Cry基因在不同年齡段的綿羊垂體中均有表達(dá)。Cry1 蛋白在30 日齡牦牛睪丸中的表達(dá)量最低，隨著年齡的增長表達(dá)量逐漸增高[10-11]。研究哺乳動物生物鐘節(jié)律基因的表達(dá)對分析動物的季節(jié)性發(fā)情意義重大。但目前對Cry1 蛋白在綿羊生殖軸系中表達(dá)定位的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對發(fā)情期綿羊生殖軸系中Cry1 蛋白的表達(dá)進(jìn)行了研究，對Cry 蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為分析動物繁殖與生物鐘之間的聯(lián)系提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 樣品采自于甘肅省蘭州市小西湖屠宰場，選健康成年雄性綿羊6 頭，頸部放血致死，采集松果體、下丘腦、垂體、睪丸和附睪組織，將這些組織分成2 份，一份置于液氮中保存，另一份置于10% 的福爾馬林中保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 免疫組化實(shí)驗(yàn)所用到的抗體：一抗rabbit anti-CRY1，二抗Affinipure goat anti-rabbit IgG、rabbit anti-β-actin、免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物公司；RNA 提取試劑盒、蛋白Marker、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；高效RIPA 裂解液（組織/細(xì)胞）、Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶公司。

1.2.2 儀器 AO-820 組織切片機(jī)（Reichert，美國）；HI1210 攤片機(jī)（徠卡，上海）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀LightCycler96（Roche，瑞士）；微型垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)印槽（伯樂公司，美國）；DP71 顯微鏡（Olympus，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Quantitative RT-PCR 反應(yīng) 各組織中RNA 的提取嚴(yán)格按照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，并用超微量核酸蛋白測定儀測定RNA 濃度，用0.1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA 鏈，保存于-20℃冰箱備用。所用引物設(shè)計(jì)參考羅萬偉等[9]，其序列號為Cry1（NM_001129735）、內(nèi)參基因GAPDH（NM_001190390）。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

計(jì)算完畢后，比較竣工和設(shè)計(jì)標(biāo)高差異值。其中在公式（2）中的可以直接作為實(shí)際施工立模標(biāo)高。正向分析法主要是按照實(shí)際施工的步驟順序進(jìn)行橋梁施工數(shù)據(jù)的分析測算，合理解決了傳統(tǒng)的倒裝分析法不可避免的橋梁連續(xù)施工混凝土收縮不變的計(jì)算問題[3]。假設(shè)在實(shí)際計(jì)算過程中，橋梁施工單位在第一階段應(yīng)力并沒有通過，也可以及時(shí)進(jìn)行調(diào)整。此外，正向分析法可以充分考慮設(shè)計(jì)資料和相應(yīng)施工方案，對橋梁結(jié)構(gòu)工程、施工工作以及后續(xù)的工程監(jiān)管融為一體，保證監(jiān)管工作的現(xiàn)實(shí)性和針對性。

表1 引物序列

以cDNA 為模板，qPCR 反應(yīng)總體系為20 μL：模板1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，0.05 μmol/μL上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，循環(huán)次數(shù)45 次[12-13]。所得相關(guān)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算，每個(gè)基因相對表達(dá)量均以內(nèi)參基因?yàn)榛鶞?zhǔn)進(jìn)行校正。qPCR 結(jié)果用3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示（X±SEM），所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行One-way ANOVA 顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，用GraphPad Prism 5 作圖。

1.3.2 用免疫組織化學(xué)定位方法檢測蛋白分布 參照Lincoln 等[14]的免疫組織化學(xué)法，檢測Cry1 蛋白在各組織中的表達(dá)定位，具體步驟如下：將常規(guī)石蠟切片65℃烤片1 h 后進(jìn)行脫蠟處理，之后用PBS 洗3 次，每次5 min。再將切片置于枸櫞酸緩沖液中高壓修復(fù)1 min，自然晾至室溫后用PBS 洗3 次，每次3 min。用3%H2O2濕盒孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用PBS沖洗5 min。滴加封閉液，室溫濕盒孵育30 min，傾去。滴加anti-Cry1 一抗，稀釋比例為1:400，對照組用PBS代替。4 ℃濕盒孵育過夜。PBS 洗3 次，每次3 min。滴加二抗，不需要稀釋，室溫濕盒孵育60 min，PBS洗3 次，每次5 min。滴加1 滴DAB 工作液進(jìn)行顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，約5 min，用蒸餾水終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染5～8 min（時(shí)間視顯微鏡觀察結(jié)果來定），0.1% HCl 分化，自來水沖洗，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后用Olympus DP71 顯微鏡觀察并照相。

1.3.3 Western blotting 分析 將組織用液氮研磨成糊狀后，稱取20 mg 加入250 μL 蛋白裂解液，用渦旋混勻器混勻后，10 000 r/min 4℃離心15 min，取上清[15]，用Lowry 法蛋白濃度測定試劑盒對上清中的蛋白含量進(jìn)行檢測，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。剩余蛋白上清分裝后凍存至-80℃冰箱中。

Western blotting 步驟參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[16]。分離膠濃度為10%，蛋白上樣量為30 μg，相應(yīng)的一抗（按1:1 000 的比例溶解于含5%脫脂奶粉的TBST 溶液）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記相應(yīng)的二抗（按1:8 000 的比例溶解于含5% 脫脂奶粉的TBST 溶液）室溫孵育2 h。用PBS 在搖床上洗滌2 h，中間多次更換PBS。用高靈敏度化學(xué)發(fā)光液ECL 檢測試劑盒顯影結(jié)果，用X 膠片曝光并進(jìn)行拍照。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 登錄表2 所列網(wǎng)址[17-19]，在序列搜索欄中輸入從NCBI 獲取的Cry1 蛋白質(zhì)序列（XP_012014825.2），對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、親水性、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和蛋白的同源性進(jìn)化分析等作出預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1Cry基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測qPCR 結(jié)果顯示，雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達(dá)。Cry基因在下丘腦中的表達(dá)最高，其次為睪丸，在垂體中表達(dá)最少。以垂體為參照，各組織中Cry1基因的相對含量與垂體相比差異顯著（圖1-a）。Western blotting 結(jié)果印證了qPCR 結(jié)果，Cry1 蛋白在整個(gè)生殖軸系均有表達(dá)，在下丘腦中的表達(dá)最高（圖1-b）。

2.2 Cry1 蛋白在雄性綿羊生殖軸系各組織中的表達(dá)HE 染色結(jié)果顯示，雄性綿羊各組織細(xì)胞形態(tài)正常，為健康動物（圖2-a1～e1）。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組背景都為藍(lán)色陰性（圖2-a2～e2），anti-Cry1 實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)組織中均出現(xiàn)免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物（黃色或棕色）。在松果體中，松果體細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的90%左右，其余主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。anti-Cry1 實(shí)驗(yàn)組顯示Cry1蛋白在松果體中呈彌散性表達(dá)，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均呈陽性表達(dá)，且著色較深（圖2-a3）。在下丘腦中，胞體呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等。實(shí)驗(yàn)組免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈深淺不等的棕黃色，胞核、胞質(zhì)和胞膜均呈陽性反應(yīng)（圖2-b3）。在垂體結(jié)節(jié)部中，anti-Cry1 主要在縱形毛細(xì)血管及索狀縱向排列于血管間的腺細(xì)胞表達(dá)（圖2-c3）。睪丸組織切片經(jīng)免疫組化染色后，免疫陽性物質(zhì)均主要分布在睪丸的基膜和間質(zhì)細(xì)胞中（圖2-d3）。在附睪上，管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子呈陽性表達(dá)（圖2-e3）。結(jié)果顯示在下丘腦-垂體-性腺軸上都有Cry1 蛋白的存在，暗示生物鐘基因在動物的繁殖發(fā)育上發(fā)揮重要作用。

表2 生物信息學(xué)分析登錄網(wǎng)址

圖1 Cry1 基因在雄性綿羊生殖軸系各組織的定量檢測

圖2 Cry 蛋白的免疫組化結(jié)果

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 Cry1 蛋白理化性質(zhì)及親水性分析 使用Protparam在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示Cry1 蛋白由587 個(gè)氨基酸組成，分子量為66.4 kDa，理論等電點(diǎn)是8.27，半衰期是30 h，消光系數(shù)（280 nm）是124 175，肽鏈N 端是蛋氨酸，為不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)是79.78。

使用ProtScale 在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白的親水性，預(yù)測結(jié)果如圖3 所示，0 值以上用來表示疏水區(qū)，該區(qū)段的分值越高則表示所測蛋白的疏水性越強(qiáng)，0 值以下用來表示親水區(qū)，該區(qū)段的分值越低，則表示所測蛋白的親水性越強(qiáng)。Cry1（-0.391）為親水性蛋白質(zhì)。

圖3 Cry1 蛋白親水性分析

2.3.2 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)預(yù)測 使用NetPhos 3.1在線軟件預(yù)測Cry1 蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果如圖4 所示，Cry1 蛋白的氨基酸序列上存在53 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中位于絲氨酸（Ser）的有33 個(gè)，位于蘇氨酸（Thr）的有14 個(gè)，位于酪氨酸（Tyr）的有6 個(gè)。Cry1 蛋白的糖基化位點(diǎn)有23 個(gè)。

圖4 Cry1 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.3.3 蛋白質(zhì)信號肽、跨膜域及二級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析 通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)Cry1 蛋白無信號肽信息，表明該蛋白不是分泌蛋白，且Cry1 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。Cry1 蛋白二級結(jié)構(gòu)元件有α螺旋229 個(gè)（39.08%）、無規(guī)卷曲258個(gè)（44.03%）、伸展鏈63 個(gè)（10.75%）、β-轉(zhuǎn)角36個(gè)（6.14%）。

2.3.4 Cry1 蛋白的亞細(xì)胞定位及蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Cry1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)（52.2%）、細(xì)胞核（21.7%）、分泌囊泡（4.3%）、細(xì)胞骨架（4.3%）。Cry1 蛋白含有1 個(gè)DNA 裂解酶的FAD 結(jié)構(gòu)域，存在于288～486位氨基酸；還有1 個(gè)PhrB 超家族結(jié)構(gòu)域，存在于6～491 位氨基酸（圖5）。

圖5 Cry1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3.5 Cry1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Cry1 蛋白建模模板為4k0r.1.A，其相似性為95.90%，可信度為97.62%（圖6）。

圖6 Cry1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.6 不同物種Cry1 蛋白的進(jìn)化分析 通過同源性比對分析發(fā)現(xiàn)（圖7），與羊的Cry1 氨基酸序列最為相近的動物是牛，同源性為99.1%，之后依次為鹿（98.6%）、豬（98.1%）、狗（98.0%）、貓（97.7%）、馬（97.2%）、鼠（95.4%）、雞（92.5%）、人（90.3%）。由圖8 可見，綿羊的Cry1 氨基酸序列與牛和鹿最為接近。

3 討 論

通過qPCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)顯示，雄性綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1基因的表達(dá)，因此暗示Cry基因通過下丘腦-垂體-性腺軸參與哺乳動物生殖調(diào)控。Cry1在下丘腦中的表達(dá)最高，但這一結(jié)果與高磊等[20]在綿羊性腺軸上Cry基因表達(dá)的結(jié)果不相符，其結(jié)果為松果體中Cry基因的表達(dá)量明顯比其他組織的表達(dá)量高。但本研究結(jié)果與生物鐘基因主要存在于下丘腦的視交叉上核的結(jié)果相印證[1]。

圖7 Cry1 氨基酸序列的同源性比對

圖8 Cry1 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cry 蛋白在雄性綿羊松果體及生殖軸系中均廣泛表達(dá)，與qPCR 的結(jié)果相一致。在松果體和下丘腦中，Cry 蛋白成彌散性表達(dá)，胞膜、胞質(zhì)及胞核均有陽性表達(dá)。在垂體上Cry 蛋白主要位于毛細(xì)血管的管壁細(xì)胞和血管周圍的腺細(xì)胞上，這說明血液中的某些成分對Cry 蛋白有很大影響。在睪丸上，Cry 蛋白主要位于睪丸的基膜和間質(zhì)細(xì)胞。在附睪上，Cry1 蛋白在管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子上呈陽性表達(dá)，這說明Cry 蛋白在精子經(jīng)過附睪的過程中，對其發(fā)育成熟發(fā)揮較大作用。有研究表明，與正常小鼠相比，Cry1基因敲除小鼠的精細(xì)胞發(fā)生改變，凋亡數(shù)目明顯增加，數(shù)量明顯減少，但血清睪酮濃度改變不明顯[21]。Bur 等[22]證明了Cry1和Cry2作為晝夜節(jié)律鐘的組成部分，對于維持雌性和雄性小鼠的性別二型性是必要的，具體來說，雙突變體Cry1-/-Cry2-/-雄鼠不能按需表達(dá)雄激素，其性激素水平與雌鼠相似，同時(shí)敲除Cry1與Cry2基因小鼠的生物鐘節(jié)律則完全喪失。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Cry 蛋白為堿性蛋白質(zhì)，為親水性蛋白質(zhì)，無信號肽信息和跨膜結(jié)構(gòu)，主要的二級結(jié)構(gòu)元件是α 螺旋和無規(guī)卷曲。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Cry1 蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)綿羊的Cry1 蛋白與牛、鹿的分子進(jìn)化距離最近，說明其親緣關(guān)系最為密切。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定功能[23-24]。為保證預(yù)測分析的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)采用了多種分析軟件，雖然各種軟件的原理和算法有所不同，但是結(jié)果的相似性極高，說明預(yù)測結(jié)果具有較高的可信度。

有文獻(xiàn)報(bào)道[25]，只敲除小鼠的Cry1基因，或者只敲除小鼠Cry2基因，小鼠的生物鐘節(jié)律沒有被損壞，并且小鼠的SCN 核團(tuán)依然維持著完整的轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路。敲除Cry1基因后，小鼠不論在行為水平還是在主時(shí)鐘的調(diào)控水平上表現(xiàn)出的生物鐘節(jié)律為短周期。敲除Cry2基因后，小鼠的生物鐘節(jié)律表現(xiàn)為長周期。如果同時(shí)敲除Cry1基因與Cry2基因，小鼠的生物鐘節(jié)律則完全喪失[25]。研究還發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)Cry基因后，其翻譯出的Cry 蛋白增多，CLOCK 和BMAL1 異二聚體的轉(zhuǎn)錄活性會被Cry 蛋白抑制[26]?？梢?，Cry1基因?qū)ι镧姷姆€(wěn)定性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)成功得出Cry1基因在雄性綿羊生殖軸各組織中均有表達(dá)，在下丘腦中的表達(dá)最高，睪丸次之，在睪丸組織的基膜和間質(zhì)細(xì)胞，以及附睪管腔上皮細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和腔面精子上呈陽性表達(dá)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在綿羊生殖軸系各組織中均有Cry1的表達(dá)，下丘腦表達(dá)最多，暗示作為生物鐘基因之一的Cry1參與了哺乳動物的生殖調(diào)控，為生物鐘調(diào)控哺乳動物的季節(jié)性繁殖提供了一定的研究基礎(chǔ)。