基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路探討黃芪甲苷對(duì)慢性腎衰竭大鼠鈣磷代謝紊亂的改善作用及機(jī)制

尤云 洪麗萍 張宏濤

1.信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院 河南，信陽 464000 2.鄭州頤和醫(yī)院 3.河南省人民醫(yī)院

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種原因造成的腎損傷發(fā)展到一定階段的結(jié)果，腎臟組織萎縮，無法維持基本功能，導(dǎo)致體內(nèi)代謝產(chǎn)物蓄積，水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，最終全身各系統(tǒng)受累[1]。鈣磷代謝紊亂是CRF的特征，可導(dǎo)致體內(nèi)活性維生素D代謝異常與成纖維生長因子-23分泌紊亂，繼發(fā)腎性骨病、甲狀旁腺功能亢進(jìn)及血管鈣化等情況，并加重腎功能的惡化，形成惡性循環(huán)，對(duì)患者預(yù)后造成極大影響[2-3]。因此，對(duì)CRF鈣磷代謝紊亂及時(shí)采取有效的干預(yù)和防治措施具有重要意義。

黃芪甲苷（astragaloside-Ⅳ，AS-Ⅳ）是中藥黃芪的有效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎、抗衰老、降壓、改善血液循環(huán)、降糖等多種作用[4]。研究證實(shí)，AS-Ⅳ具有腎臟保護(hù)作用，可降低腎性高血壓，抑制腎臟纖維化，緩解病理損傷[5]。目前關(guān)于AS-Ⅳ對(duì)腎臟保護(hù)的相關(guān)研究較多，但對(duì)CRF鈣磷代謝紊亂的影響的相關(guān)研究較少。故本研究通過建立CRF鈣磷代謝紊亂大鼠模型，探討AS-Ⅳ對(duì)鈣磷代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制，旨在為CRF鈣磷代謝紊亂的藥物防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性Wistar大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量220～240g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（豫）2015-0005]，飼養(yǎng)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（豫）2016-0002]。大鼠購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境清潔通風(fēng)，溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，12h晝夜節(jié)律。

1.2 主要試劑和儀器 AS-Ⅳ購于南京澤郎生物科技有限公司（批號(hào)：ZL120305，純度≥98%）；骨化三醇膠囊購于青島正大制藥有限公司（國藥準(zhǔn)字：H20030491）；兔抗大鼠Wnt4多克隆抗體、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體均購于武漢艾美捷科技有限公司 （批號(hào)：AAF2162a、ABP50538）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 （批號(hào)：ZB-2305）；血清肌酐（serum creatinine，Scr）檢測(cè)試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司（批號(hào)：JL18878）；血尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN）、鈣（calcium，Ca）、磷（phosphorus，P）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測(cè)試劑盒購于美國Solarbio公司（批號(hào)：BC1530、BC0720、BC1650、BC2140）； 甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）檢測(cè)試劑盒購于南京森貝伽生物科技有限公司（批號(hào)：SBJ-R0596）。BK-800全自動(dòng)生化分析儀購于山東博科科學(xué)儀器有限公司；BX51T-PHD-J11型顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；RM2015型石蠟切片機(jī)購于德國萊卡公司；3550UV型酶標(biāo)儀、7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；iRICELL型全自動(dòng)尿液分析儀購于美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CRF鈣磷代謝紊亂大鼠模型建立 建模參照文獻(xiàn)[6-7]，采用5/6腎切除（左腎切除2/3，右腎全切）及高磷飲食建立CRF鈣磷代謝紊亂模型。大鼠術(shù)前禁食不禁水12h，稱重后仰臥位固定，常規(guī)備皮消毒，以6mL/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，于左腎肋角部行長約2cm切口，逐層切開至腹腔，暴露左側(cè)腎臟，分離腎周脂肪及腎被膜，以止血鉗夾緊腎蒂，切除約2/3的左腎組織，明膠海綿壓迫止血，確認(rèn)無出血后復(fù)位左腎，逐層縫合，術(shù)后給予青霉素7.2mU/100g腹腔注射，1次/d，連續(xù)3d。7d后再次手術(shù)完全剝離摘除右腎，麻醉、手術(shù)過程及術(shù)后處理同上。術(shù)后予1.2%高磷飼料飼養(yǎng)，持續(xù)4周。第4周后尾靜脈采血，檢測(cè)Scr、BUN水平，以Scr、BUN≥正常值2倍為造模成功。

1.3.2 分組及干預(yù) 60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、AS-Ⅳ低劑量組、AS-Ⅳ高劑量組、西藥組，各組12只。假手術(shù)組術(shù)中僅分離腎臟包膜，無腎臟切除，其余各組均采用5/6腎切除（左腎切除2/3，右腎全切）及高磷飲食建立CRF鈣磷代謝紊亂模型。建模及干預(yù)期間，模型組死亡3只，AS-Ⅳ低劑量組與西藥組各死亡2只，AS-Ⅳ高劑量組死亡1只，剔除各組死亡大鼠。

取建模成功大鼠，按照成人-大鼠體表面積等效換算，AS-Ⅳ以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解，AS-Ⅳ低劑量組、AS-Ⅳ高劑量組分別按20mg·kg-1、80mg·kg-1的劑量灌胃給藥；模型組、假手術(shù)組則予0.5%羧甲基纖維素鈉2mL·kg-1灌胃；骨化三醇膠囊破開后內(nèi)容物以0.5%羧甲基纖維素鈉配制成質(zhì)量濃度為0.252μg/56mL的混懸液，西藥組以骨化三醇混懸液0.045μg·kg-1灌胃。 各組給藥均1次/d，連續(xù)6周。

1.3.3 腎功能指標(biāo)及礦物代謝水平檢測(cè) 藥物干預(yù)完成后第2天，大鼠以代謝籠法收集24h尿液，3 000r/min離心15min后取上清液，以尿液分析儀檢測(cè)24h尿蛋白定量。尿液收集后大鼠逐一稱重，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，取腹主動(dòng)脈血5mL，3 000r/min離心15min，分離血清，-20℃冰箱保存，以全自動(dòng)生化分析儀及相關(guān)試劑盒檢測(cè)Scr、BUN、Ca、P、ALP、PTH水平。

1.3.4 腎臟組織病理學(xué)觀察 各組大鼠腹主動(dòng)脈抽血后迅速分離殘余左腎，去包膜，0.9%氯化鈉沖洗后，各組隨機(jī)選取4只左腎，置于4%多聚甲醛緩沖液中固定24h，乙醇脫水，石蠟包埋，制成5μm厚度切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)大鼠腎臟組織Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá) 殘腎分離固定及切片同1.3.4，切片常規(guī)脫蠟入水，組織抗原修復(fù)，置于3%H2O2液中室溫孵育30min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，加入一抗（稀釋比例：1∶200），4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30min，PBS沖洗后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，顯微鏡下觀察，蘇木素復(fù)染核5s，1%鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，高倍鏡下觀察各組腎組織Wnt4、βcatenin表達(dá)分布。陽性染色為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或細(xì)胞膜呈棕褐色。每組隨機(jī)選擇10張切片，每張切片隨機(jī)選取定點(diǎn)下5個(gè)相鄰的視野，以Image-Pro-Plus圖像分析軟件測(cè)量每視野的平均光密度值（integral optical density，IOD），IOD值越高說明表達(dá)水平越高。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantificational Real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR） 檢測(cè)大 鼠腎 臟組 織Wnt4、βcatenin mRNA的表達(dá) 殘腎分離同1.3.4，取-80℃保存的腎組織，Trizol試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參基因，qRTPCR檢測(cè)Wnt4、β-catenin mRNA表達(dá)情況，根據(jù)試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性5min，95℃變性35s，55℃退火38s，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)，72℃再次延伸8min。以2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Wnt4、β-catenin、GAPDH引物序列設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩樣本比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）-t檢驗(yàn)。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較 各組間比較，血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、西藥組、AS-Ⅳ各劑量組血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 與模型組比較，西藥組、AS-Ⅳ各劑量組血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。 與西藥組比較，AS-Ⅳ高劑量組血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，P＜0.01）；AS-Ⅳ低劑量組血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ高劑量組血清Scr、BUN及24h尿蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 見表2。

表2 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

表2 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與AS-Ⅳ低劑量組比較，▲▲P＜0.01Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with western medicine group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with AS-Ⅳ low-dose group，▲▲P＜0.01

組別 n S c r（μ m o l·L-1） B U N（m m o l·L-1） 2 4 h 尿蛋白（m g）假手術(shù)組 1 2 4 0.5 8±5.9 8 7.8 8±1.2 2 4.7 0±1.1 5模型組 9 1 0 5.3 6±1 0.3 5** 2 0.3 5±3.0 1** 1 4.8 5±2.3 3**西藥組 1 0 9 0.5 8±7.0 5**## 1 7.0 1±2.5 0**# 1 2.0 2±1.7 4**##A S-Ⅳ低劑量組 1 0 9 2.3 5±8.5 7**## 1 6.3 3±2.8 9**## 1 2.3 5±2.0 1**#A S-Ⅳ高劑量組 1 1 8 1.8 5±7.5 4**##△▲▲ 1 2.4 8±2.5 0**##△△▲▲ 9.2 5±1.8 0**##△△▲▲

2.2 各組大鼠礦物質(zhì)代謝指標(biāo)比較 各組間比較，Ca、P、ALP、PTH差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、西藥組、AS-Ⅳ各劑量組血清Ca水平降低，P、ALP、PTH水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 與模型組比較，西藥組、AS-Ⅳ各劑量組血清Ca水平升高，P、ALP、PTH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。 與西藥組比較，AS-Ⅳ低劑量組血清Ca水平降低，ALP、PTH水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；高劑量組血清P水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ高劑量組血清Ca水平升高，P、ALP、PTH水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。西藥組與AS-Ⅳ低劑量組血清P水平，西藥組與AS-Ⅳ高劑量組血清Ca、ALP、PTH水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠礦物質(zhì)代謝指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of mineral metabolism indexes in each group（±s）

表3 各組大鼠礦物質(zhì)代謝指標(biāo)比較（±s）Tab.3 Comparison of mineral metabolism indexes in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與AS-Ⅳ低劑量組比較，▲▲P＜0.01Note:Compared with sham operation group，**P＜0.01;compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with western medicine group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with AS-Ⅳ low-dose group，▲▲P＜0.01

組別 n Ca（mmol·L-1） P（mmol·L-1） ALP（U·L-1） PTH（pg·mL-1）假手術(shù)組 12 2.65±0.20 2.10±0.22 98.58±12.35 3.80±1.15模型組 9 1.58±0.15** 4.33±0.50** 191.32±20.32** 16.32±2.35**西藥組 10 2.32±0.18**## 3.70±0.44**# 125.58±15.74**## 9.36±1.32**##AS-Ⅳ低劑量組 10 2.01±0.17**##△ 3.82±0.48**# 160.23±17.01**##△△ 14.35±1.50**#△△AS-Ⅳ高劑量組F值P值11 2.28±0.20**##▲▲46.989＜0.001 3.20±0.50**##△▲▲35.553＜0.001 130.28±15.80**##▲▲47.056＜0.001 10.01±1.40**##▲▲103.518＜0.001

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)觀察 HE染色鏡下觀察顯示，假手術(shù)組腎單位完整，腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)則，腎間質(zhì)無病理變化。模型組可見腎小球萎縮、硬化壞死，上皮細(xì)胞數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤、水腫及纖維增生，腎小管擴(kuò)張或灶狀萎縮。西藥組腎小球中度擴(kuò)張、部分體積增大，存在局灶節(jié)段性硬化，腎小管中度擴(kuò)張，腎間質(zhì)內(nèi)部分炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生，病變較模型組輕。AS-Ⅳ低劑量組病理變化與西藥組無明顯區(qū)別。AS-Ⅳ高劑量組腎小球及腎間質(zhì)可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管部分萎縮、壞死，病理變化較西藥組及AS-Ⅳ低劑量組更輕。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（HE染色，400×）Fig.1 Pathological changes of renal tissue in each group（HE staining，400×）

2.4 各組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較 各組間比較，Wnt4、β-catenin蛋白IOD差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、西藥組、AS-Ⅳ各劑量組的Wnt4、β-catenin蛋白IOD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，西藥組、AS-Ⅳ各劑量組的Wnt4、β-catenin蛋白IOD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與西藥組比較，AS-Ⅳ高劑量組的Wnt4、β-catenin蛋白IOD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ高劑量組的Wnt4、β-catenin蛋白IOD降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。西藥組與AS-Ⅳ低劑量組Wnt4、β-catenin蛋白IOD比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表4、圖2。

表4 各組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of Wnt4 and β-catenin protein expression in each group（±s）

表4 各組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白表達(dá)比較（±s）Tab.4 Comparison of Wnt4 and β-catenin protein expression in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與AS-Ⅳ低劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with western medicine group，△P＜0.05，△△P＜0.01;compared with AS-Ⅳ low-dose group，▲P＜0.05

組別 n Wnt4 β-catenin假手術(shù)組 4 0.10±0.02 0.08±0.02模型組 4 0.33±0.05** 0.25±0.04**西藥組 4 0.23±0.04**# 0.18±0.03**#AS-Ⅳ低劑量組 4 0.22±0.04**# 0.17±0.03**#AS-Ⅳ高劑量組 4 0.15±0.03*##△▲ 0.12±0.01*##△△▲F值 101.521 38.080 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖2 各組大鼠Wnt4、β-catenin免疫組化檢測(cè)（400×）Fig.2 Immunohistochemical detection of Wnt4，β-catenin in each group（400×）

2.5 各組大鼠Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 各組間比較，Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組、西藥組、AS-Ⅳ各劑量組的Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，西藥組、AS-Ⅳ各劑量組的Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。 與西藥組比較，AS-Ⅳ高劑量組的Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與AS-Ⅳ低劑量組比較，AS-Ⅳ高劑量組的Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組與AS-Ⅳ低劑量組比較，Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表5。

表5 各組大鼠Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression of Wnt4 and β-catenin mRNA in each group（±s）

表5 各組大鼠Wnt4、β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)量表達(dá)比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression of Wnt4 and β-catenin mRNA in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05；與AS-Ⅳ低劑量組比較，▲P＜0.05Note:Compared with sham operation group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01;compared with western medicine group，△P＜0.05;compared with AS-Ⅳ low dose group，▲P＜0.05

組別 n Wnt4 β-catenin假手術(shù)組 4 1.05±0.05 1.00±0.7模型組 4 1.83±0.16** 1.78±0.12**西藥組 4 1.40±0.15**## 1.35±0.10**##AS-Ⅳ低劑量組 4 1.42±0.15**# 1.40±0.12**##AS-Ⅳ高劑量組 4 1.18±0.08*##△▲ 1.15±0.08*##△▲F值 22.21 34.822 P值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

機(jī)體的鈣磷穩(wěn)態(tài)平衡受PTH、1，25-二羥維生素D3、降鈣素及成纖維細(xì)胞因子-23的相互調(diào)控[8]。CRF患者腎損傷早期，血磷、鈣、PTH水平基本維持正常，隨著病情的進(jìn)展，腎功能進(jìn)一步惡化，1，25-二羥維生素D3合成受到抑制，刺激甲狀旁腺增生，PTH水平升高超過正常代償范圍，繼而出現(xiàn)低鈣及高磷血癥，并引起繼發(fā)性的甲狀旁腺功能亢進(jìn)，加重水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致殘余腎功能進(jìn)一步下降[9]。腎臟替代治療是CRF晚期的有效治療手段，但治療費(fèi)用昂貴，且受醫(yī)療資源限制，仍有部分患者無法獲得腎臟替代治療，因此在CRF早期采用有效的藥物調(diào)節(jié)鈣磷平衡具有重要意義。西藥治療CRF鈣磷代謝紊亂主要采用鈣磷結(jié)合劑、鈣受體激動(dòng)劑等藥物，但是西藥單因素靶向治療容易導(dǎo)致高鈣、高磷血癥，治療效果往往并不滿意。目前中藥治療CRF鈣磷代謝紊亂已在臨床應(yīng)用，中藥具有多靶點(diǎn)、多活性的作用特點(diǎn)，為CRF鈣磷代謝紊亂的治療研究提供了新的方向。

黃芪是具有補(bǔ)血養(yǎng)血、解毒生肌、固表益氣、利水消腫等多種功效的中藥，其有效成分為多糖和皂苷[10]。AS-Ⅳ作用與黃芪多糖類似，但藥效是黃芪多糖的2倍，包括保護(hù)腎臟及心血管、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫等[11]。研究顯示，AS-Ⅳ可抑制應(yīng)激反應(yīng)警戒期的腎上腺增生與胸腺萎縮，阻止應(yīng)激反應(yīng)抵抗期和衰竭期出現(xiàn)的異常變化，起到拮抗應(yīng)激的作用；并能抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞的生理代謝，改善血液循環(huán)[12-13]。王雅寧等[14]研究中發(fā)現(xiàn)，AS-Ⅳ能調(diào)節(jié)腎組織的氧化還原狀態(tài)，抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管損傷。陳清青[15]發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ可抑制氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)反應(yīng)，從而阻止足細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，模型組較假手術(shù)組血清Ca水平更低，P、ALP、PTH、Scr、BUN及24h尿蛋白水平更高，病理學(xué)觀察提示存在明顯的腎小球萎縮、硬化壞死，炎癥浸潤增生及纖維化等損傷表現(xiàn)，說明模型組大鼠存在鈣磷代謝紊亂及腎功能衰竭的病理生理改變。經(jīng)AS-Ⅳ干預(yù)后，血清Ca水平升高，P、ALP、PTH、Scr、BUN及24h尿蛋白水平下降，病理切片顯示腎小球萎縮、硬化壞死、炎癥浸潤增生及纖維化等病理損傷減輕，且AS-Ⅳ高劑量組的血清P、Scr、BUN及24h尿蛋白水平低于西藥組，病理改變較西藥組更輕，提示AS-Ⅳ可改善CRF大鼠腎功能及鈣磷代謝紊亂，減輕腎臟病理損傷，較常規(guī)的西藥單因素靶向治療具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。

腎足細(xì)胞的損傷凋亡是導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率下降、腎功能惡化的重要病理因素，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎足細(xì)胞損傷、凋亡，腎小球纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。Wnt/β-catenin是進(jìn)化保守的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，參與調(diào)節(jié)多種生物過程，在維持和正向調(diào)節(jié)腎組織與腎單位發(fā)育中具有重要作用[17]。正常情況下，Wnt信號(hào)通路未激活時(shí)，絡(luò)氨酸激酶Ⅰα和糖原合成酶激酶-3β可促使β-catenin磷酸化，磷酸化的βcatenin被泛素化和蛋白酶體降解，使胞質(zhì)中的βcatenin濃度處于低水平[18]。腎功能受損時(shí)，Wnt信號(hào)被激活，Wnt蛋白能與Frizzled受體及其他相關(guān)受體結(jié)合，產(chǎn)生跨膜信號(hào)傳導(dǎo)，使β-catenin去磷酸化并易位進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，刺激Wnt的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)腎足細(xì)胞損傷[19]。另有研究顯示，PTH水平升高可誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的再激活[20]。陳亞茹等[21]則發(fā)現(xiàn)，抑制Wnt的亞型表達(dá)可降低β-catenin表達(dá)水平，阻斷腎臟β-catenin介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄，說明CRF鈣磷代謝紊亂與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究結(jié)果提示，西藥組、AS-Ⅳ各劑量組的Wnt4、β-catenin蛋白IOD及mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ高劑量組較西藥組及AS-Ⅳ低劑量組更低，提示AS-Ⅳ能夠減輕鈣磷代謝紊亂，抑制腎臟損傷，從而改善CRF大鼠的腎功能，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，AS-Ⅳ可抑制CRF大鼠的腎功能損傷，改善鈣磷代謝紊亂，減輕腎臟病理損傷，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究結(jié)果提示，在今后CRF鈣磷代謝紊亂的藥物研究中，可將AS-Ⅳ相關(guān)藥物作為選擇之一。