濃縮配制BPW增菌液對沙門氏菌檢測效果的影響

梁煜拓，韓佳憫，何嘉明，馬健聰

（佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣東佛山 528000）

沙門氏菌引起的中毒病例在世界各地的食物中毒病例中所占數(shù)量比例非常高[1-2]。資料統(tǒng)計(jì)顯示，我國70%～80%細(xì)菌性食物中毒事件是由沙門氏菌引起[3]。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《預(yù)包裝食品中致病菌限量》 （GB 29921—2021），要求對易受沙門氏菌污染的食品進(jìn)行分類管理，以使大多數(shù)食品不含沙門氏菌，從而有效地預(yù)防沙門氏菌食物中毒事件[4]。為此，各實(shí)驗(yàn)室非常重視沙門氏菌的檢測工作，目前檢測方法有傳統(tǒng)分離鑒定法、免疫抗體法（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ，ELISA）、分子生物學(xué)法（Polymerase Chain Reaction，PCR）等。

由于食品在生產(chǎn)加工過程中，經(jīng)過蒸煮、烘烤、腌制、冷凍和防腐等因素的作用，其中的沙門氏菌會受到非致命性損傷，在含量低且分布不均的情況下，很難直接從食品中檢測出來，極易出現(xiàn)假陰性漏檢情況。為防止帶有致病菌食品的漏檢，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，修復(fù)損傷菌并提高菌的數(shù)量后，再進(jìn)行檢測就能有效地提高檢出率，因此不管是煩瑣的傳統(tǒng)分離法，還是快捷的免疫法、靈敏的PCR法中都缺少不了前增菌步驟。在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》 （GB 4789.4—2016）中要求使用傳統(tǒng)分離法進(jìn)行沙門氏菌檢驗(yàn)：取25 g/mL樣品置于225 mL BPW中（36±1）℃培養(yǎng)8～18 h進(jìn)行非選擇性前增菌后再經(jīng)二次選擇性增菌，最后進(jìn)行分離檢測[5]。因此，需要提前配制大量BPW增菌液并每份分裝225 mL，經(jīng)121 ℃，15 min滅菌處理后備用，如先大量配制經(jīng)滅菌后再分裝會導(dǎo)致因容量過大而造成滅菌不徹底，直接購買成品分裝好的增菌液則會增加成本，且量多時(shí)也不便放置冰箱冷藏保存。隨著我國與其他國家之間的國際貿(mào)易的不斷深入，我國的沙門氏菌限量標(biāo)準(zhǔn)也與國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了接軌。鐘立霞等通過對主要國際組織和貿(mào)易國家食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中沙門氏菌限量的比較，發(fā)現(xiàn)除美國外，其他國家和組織關(guān)于沙門氏菌限量標(biāo)準(zhǔn)均要求不得檢出，但采樣量卻各不相同，各個(gè)國家普遍的采樣件數(shù)n都大于或等于5，有的國家甚至達(dá)60[6]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)也將以往要求的采樣件數(shù)n=1修改為n=5，在檢測程序不變的情況下，工作量相當(dāng)于直接增至原來的5倍。另外，基于大多食品依據(jù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求檢測致病菌沙門氏菌外，還需要檢測菌落總數(shù)、大腸菌群等衛(wèi)生指標(biāo)，然而在菌落總數(shù)、大腸菌群（n=5）等項(xiàng)目檢測時(shí)也需同樣取25 g/mL樣品于225 mL滅菌生理鹽水稀釋液中均質(zhì)后，僅吸取幾毫升樣品液進(jìn)行檢測，剩下的樣品液便丟棄。此時(shí)把濃縮配制的BPW增菌液直接加到剩下的樣品液中搖勻，進(jìn)行沙門氏菌前增菌后再檢測，減少了重復(fù)取樣。在工作量大，且不能有效地提高自動化檢測程度時(shí)，通過合理地改良配制方法，既避免重復(fù)取樣工作，又便于增菌液配制、使用和保存，能有效減輕工作量，提高檢測效率，實(shí)用性意義顯著。

本文選擇4株沙門氏菌，包括1株標(biāo)準(zhǔn)菌株和3株常見的實(shí)驗(yàn)室分離株[7-8]，按照GB 4789.4—2016對兩種不同配制方式的BPW增菌液進(jìn)行均勻度、增菌效果、檢測靈敏度測試，以及在13類雜菌污染程度較高的預(yù)包裝食品中人工污染3種常見沙門氏菌分離株，比較其在不同的樣品環(huán)境和嚴(yán)重雜菌干擾影響下的檢測效果差異，評價(jià)BPW先濃縮配制后再添加使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胰蛋白胨大豆瓊 脂（Tryptone soya agar，TSA）、腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（Brain heart infusion medium，BHI）、緩沖蛋白胨 水（Buffer peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（Tetrathionate broth base，TTB），北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；沙門顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉）、VIDAS SLM試劑盒，法國生物梅里埃公司；沙門氏菌診斷血清，寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

常規(guī)BPW配制：按商品使用說明書把培養(yǎng)基按配方20 g/L比例稱取溶解均勻后分裝225 mL/瓶，經(jīng)121 ℃，15 min滅菌后備用，每瓶含培養(yǎng)基成分4.5 g。

濃縮BPW配制：把培養(yǎng)基按45 g/100 mL的配方比例配制100 mL/瓶，121 ℃，15 min滅菌后備用，每瓶含培養(yǎng)基成分45 g（以下簡稱濃縮BPW）；使用時(shí)吸取10 mL濃縮BPW加入215 mL滅菌生理鹽水中稀釋均勻，得到225 mL增菌液，含培養(yǎng)基成分 4.5 g備用（以下簡稱SBPW）

mini-Vidas全自動免疫熒光分析儀，梅里埃公司。

1.2 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，CMCC(B)50115，中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心；鼠傷寒沙門氏菌分離株、腸炎沙門氏菌分離株、德爾卑沙門氏菌分離株，由佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心食品檢測中分離。

1.3 檢測樣品

經(jīng)佛山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心食品檢測后余樣，選取13個(gè)食品類別中雜菌含量較高的樣品代表各1份。具體樣品情況如表1所示。

表1 檢測樣品情況

1.4 方法

1.4.1 配制成分均勻度測試

（1）pH緩沖體系。取225 mL BPW和225mL SBPW分別倒入燒杯中，放置磁力攪拌器上，插入pH計(jì)，滴定1 mol/L NaOH，使pH計(jì)顯示8.0，記錄滴定量；再取225 mL BPW和225 mL SBPW分別倒入燒杯中，放置磁力攪拌器上，插入pH計(jì)，滴定 1 mol/L HCL，使pH計(jì)顯示6.0，記錄滴定量。平行測試2組，比較兩種增菌液對酸堿的緩沖能力。

（2）蛋白質(zhì)含量。充分混勻BPW和SBPW，分別吸取10 mL至消化管中，再加入0.4 g CuSO4、6 g K2SO4及20 mL H2SO4于消化爐進(jìn)行消化，取出冷卻后加入50 mL水，于自動凱氏定氮儀上自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)。平行測試4組，比較兩種增菌液主要蛋白質(zhì)成分的配制均勻性差異。

1.4.2 增菌效果比較

將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到BHI肉湯培養(yǎng)過夜，進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7（菌落計(jì)數(shù)為 97 CFU/mL），分別吸1 mL加入100 mL BPW增菌液和100 mL SBPW增菌液中，于36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，渦旋儀振蕩1 min充分均勻，取0 h 、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、24 h、36 h和48 h的培養(yǎng)物1 mL于平板中傾注TSA，36 ℃培養(yǎng)18 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4.3 檢測靈敏度比較

將鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到BHI肉湯培養(yǎng)過夜，進(jìn)行10倍系列稀釋至10-10菌液備用，取10-7、10-8、10-9、10-10菌液1 mL分別接種到225 mL BPW增菌液和225 mL SBPW增菌液中，每組稀釋度接種3個(gè)平行，36 ℃，18 h培養(yǎng)，接種1 mL于TTB增菌液中培養(yǎng)24 h后分離劃線于沙門氏菌顯色平板上進(jìn)行培養(yǎng)，通過觀察顯色平板上的生長情況對檢測靈敏度作出評價(jià)。

1.4.4 人工污染樣品檢測比較

（1）菌液制備。將鼠傷寒沙門氏菌分離株、腸炎沙門氏菌分離株、德爾卑沙門氏菌分離株分別接種到BHI肉湯培養(yǎng)過夜，進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8菌液備用，并同時(shí)各取1 mL備用菌液傾注TSA平板36 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到備用菌液的濃度分別為7 CFU/mL、3 CFU/mL、6 CFU/mL。

（2）樣品處理及增菌、快篩。分別取25 g/mL樣品于225 mL BPW和215 mL滅菌生理鹽水稀釋液中，用均質(zhì)器均質(zhì)1min，液體樣品振蕩混勻，往215 mL滅菌生理鹽水樣品液中加入10mL濃縮BPW混勻，再往樣品勻液中分別加入1 mL 鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、德爾卑沙門氏菌10-8備用菌液，具體添加情況如表2所示，另每組設(shè)置兩個(gè)樣品空白對照，一并于36 ℃前增菌培養(yǎng)18 h，各取1 mL增菌培養(yǎng)物于10 mL TTB培養(yǎng)基中，42 ℃二次增菌 24 h。同時(shí)取2 mL前增菌培養(yǎng)物于空試管中沸水浴5 min，進(jìn)行mini-Vidas全自動免疫熒光分析儀快速篩選檢測。

表2 人工污染樣品檢測實(shí)驗(yàn)組設(shè)置

（3）分離及鑒定。取二次增菌液分別劃線接種于沙門氏菌顯色平板中，36 ℃培養(yǎng)18 h，觀察平板上是否有紫紅色可疑菌落生長，將分離到的可疑沙門氏菌純化培養(yǎng)后，進(jìn)行診斷血清凝集實(shí)驗(yàn)，凝集A-F多價(jià)血清；如有O4、HI、H2凝集，鑒定為鼠傷寒沙門氏菌；O9、O12、Hg、Hm凝集，鑒定為腸炎型沙門氏菌；O4、Hf、Hg、H[1,2]凝集，鑒定為德爾卑沙門氏菌。比較相同增菌液不同配制使用方式對沙門氏菌檢測效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種增菌液對酸堿的緩沖能力

由表3可知，兩種不同配制方式的增菌液對酸堿的緩沖能力沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表3 兩種增菌液對酸堿的緩沖能力

2.2 兩種增菌液蛋白質(zhì)成分含量

由表4可知，在兩種不同配制方式的增菌液中主要營養(yǎng)成分蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異 （P＞0.05）。

表4 增菌液中蛋白質(zhì)成分含量（單位：g/100 mL）

2.3 沙門氏菌在兩種增菌液中的增菌效果

由圖1可知，兩種增菌液的生長曲線大致相同。沙門氏菌的數(shù)量隨時(shí)間延長不斷上升，0～4 h為調(diào)整期，6～16 h為對數(shù)增長期，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。對數(shù)期細(xì)菌的數(shù)量增長最快，活力最好，最適宜進(jìn)行接種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）中規(guī)定的預(yù)增菌時(shí)間為8～18 h要求。

圖1 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株在兩種增菌液中的增菌效果

2.4 檢測敏感度結(jié)果

由表5可知，兩種增菌液對沙門氏菌最低檢出限均可達(dá)到10-9（1 CFU/225 mL），表明在檢測沙門氏菌時(shí)，SBPW增菌液的靈敏度與BPW增菌液的靈敏度相當(dāng)。

表5 兩種增菌液對沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株的最低檢出限

2.5 人工污染樣品結(jié)果

由表6、表7可知，在13個(gè)食品類別的樣品中分別少量污染3種常見沙門氏菌分離株，在不同樣品環(huán)境和雜菌干擾下，進(jìn)行競爭性增菌、選擇性分離檢測，BPW增菌液和SBPW增菌液都能全部檢出目標(biāo)沙門氏菌，檢測效果良好無差異性；但直接取18 h增菌培養(yǎng)物進(jìn)行mini-Vidas快速篩選檢測，出現(xiàn)個(gè)別食品假陰性漏檢情況。

表6 兩種增菌液檢測沙門氏菌分離株人工污染樣品結(jié)果比較

表7 mini-Vidas快篩檢測假陰性漏檢情況

3 結(jié)論與討論

BPW緩沖蛋白胨水配方依據(jù)是ISO 6579，用在GB 4789.4—2016、SN 0170—1992、ISO 6579-1:2017等標(biāo)準(zhǔn)中作為沙門氏菌非選擇性的預(yù)增菌培養(yǎng)基。由于很多食品在加工過程中會對沙門氏菌細(xì)胞造成非致命性傷害，然而BPW的作用可以修復(fù)那些受損的沙門氏菌細(xì)胞，提高沙門氏菌的活力和含量；同時(shí)食品中的防腐劑也會對沙門氏菌檢測造成不利影響，BPW還具有稀釋毒性物質(zhì)的作用。其成分中蛋白胨為細(xì)菌的生長提供氮源和碳源，能提供微生物生長所必需的核酸、蛋白質(zhì)合成原料，是不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。磷酸鹽緩沖對可以維持pH穩(wěn)定性，使多數(shù)細(xì)菌在合適pH=6.0～8.0的環(huán)境下利于生長繁殖。鑒于此培養(yǎng)基成分中蛋白胨和磷酸鹽緩沖對的重要性，如在配制過程中分裝不均勻?qū)е聽I養(yǎng)不足，就會影響增菌效果，通過對兩種不同配制方式的BPW進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和酸堿緩沖能力的測試，結(jié)果顯示無明顯的差異性，表明配制的均勻性良好，但SBPW在低溫冷藏下長期保存，底部會出現(xiàn)結(jié)晶現(xiàn)象，因此在使用前要先拿出放置室溫或熱水浴后充分搖蕩再使用，避免營養(yǎng)成分不均勻，影響增菌效果。通過增菌效果和檢測靈敏度比較，得出在兩種不同配制方式的BPW中沙門氏菌增菌生長曲線良好，均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的預(yù)增菌時(shí)間在8～ 18 h內(nèi)達(dá)到最佳生長狀態(tài)要求，且沙門氏菌最低檢出限均可達(dá)到10-9（1 CFU/225 mL）水平，檢測靈敏度較高。通過對多類食品人工污染少量沙門氏菌，在復(fù)雜的樣品環(huán)境條件和嚴(yán)重的雜菌干擾下（最高雜菌與沙門菌比例為105∶1），進(jìn)行競爭性增菌培養(yǎng)，再選擇性分離檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過BPW和SBPW預(yù)增菌后都能完全檢測出目標(biāo)沙門氏菌，沒有出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。但在兩種預(yù)增菌液中直接進(jìn)行mini-Vidas快速篩選檢測，有個(gè)別食品出現(xiàn)假陰性情況，此類樣品經(jīng)選擇性增菌后篩選檢測呈陽性。因此，在時(shí)間允許條件下，經(jīng)選擇性增菌后再進(jìn)行篩選檢測，能提高檢測效率。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出BPW先濃縮配制后再添加使用的方式可以應(yīng)用于沙門氏菌日常檢測工作中，既方便配制、使用、儲存，又減輕了重復(fù)取樣的工作量，如能生產(chǎn)一次性濃縮BPW管，使用時(shí)直接添加使用，更能提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率。