酵母菌厭氧發(fā)酵機制的教學探討

李從虎，吳 彥

（安慶師范大學生命科學學院，安徽安慶246133）

微生物發(fā)酵機理是指人類利用微生物的分解代謝與合成代謝活動，將基質(zhì)合成人們所需要的產(chǎn)品的內(nèi)在規(guī)律[1]，它是發(fā)酵工程教學的重點內(nèi)容。然而，微生物發(fā)酵機理的知識涉及碳源代謝、氮源代謝、能量代謝以及復(fù)雜的代謝控制流系統(tǒng)，知識抽象、復(fù)雜，代謝控制理論很難理解和應(yīng)用。因此，如何將該知識整合、優(yōu)化，簡明扼要地傳授給學生是發(fā)酵工程教學的當務(wù)之急。

在眾多微生物中，酵母菌具有安全性高、碳源利用率較高、代謝產(chǎn)物少和在酸性條件下易于生長繁殖的優(yōu)良特性[2]。因此，酵母菌在食品、醫(yī)藥、生物能源和單細胞蛋白等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。酵母菌的厭氧發(fā)酵機制是微生物發(fā)酵機理的重要內(nèi)容之一，掌握該知識對于發(fā)酵機理知識的融會貫通具有重要的意義。然而，目前的教材編排主要以產(chǎn)品進行分類，這導(dǎo)致學生難以厘清酵母菌的發(fā)酵。如果以酵母菌為主旨，將其發(fā)酵機制進行有效串聯(lián)，從廣度、深度和學科性上都能促進學生對微生物發(fā)酵機理知識的掌握。

1 糖酵解（EMP）途徑

EMP途徑是葡萄糖分解代謝的基本途徑之一，是酵母菌進行發(fā)酵生產(chǎn)的基本前提[4]。因此，了解和掌握EMP途徑為學生掌握酵母菌的厭氧發(fā)酵機制奠定了理論基礎(chǔ)。圖1為EMP途徑的簡明示意圖。

圖1 糖酵解（EMP）途徑簡明示意圖

EMP途徑主要發(fā)生在微生物的細胞液中，大致分為兩個階段：第一階段主要是耗能階段，由1分子葡萄糖生成2分子3-P-甘油醛，消耗2分子的ATP；第二階段是產(chǎn)能階段，主要由3-P-甘油醛轉(zhuǎn)化為丙酮酸的階段，此階段生成4分子的ATP。因此，1分子葡萄糖經(jīng)EMP途徑凈生成2分子ATP。有氧條件下，丙酮酸進入三羧酸（TCA）循環(huán)徹底氧化分解為CO2和水，并生成大量ATP；無氧條件下，丙酮酸進一步被還原成乙醇、甘油、乙酸、乳酸等各種發(fā)酵產(chǎn)物，與發(fā)酵工業(yè)有密切的關(guān)系。

己糖激酶、磷酸果糖激酶（限速酶）和丙酮酸激酶是EMP途徑的3個關(guān)鍵酶，控制著EMP途徑能否有效進行。EMP途徑的產(chǎn)能雖然較少，但是其關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)仍受到細胞內(nèi)能量水平的控制。如表1所示，當細胞內(nèi)產(chǎn)能反應(yīng)增加時，ATP含量升高，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性被抑制，導(dǎo)致EMP途徑減少；反之，當細胞內(nèi)耗能反應(yīng)增加時，ATP被分解為ADP或者AMP，ADP和AMP激活己糖激酶和磷酸果糖激酶，導(dǎo)致6-P-葡萄糖、1,6-2P果糖和3-P-甘油醛的含量增加，這3種中間代謝物含量的增加又激活了丙酮酸激酶的活性，最終促進EMP途徑的增加[1]。此外，6-P-葡萄糖、檸檬酸、NADH和丙氨酸亦分別是己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的抑制劑，使EMP減少。有報道稱，釀酒酵母進行發(fā)酵時，可在1 min內(nèi)將其細胞的能荷狀態(tài)恢復(fù)到初始水平[5]。

表1 EMP途徑調(diào)節(jié)信息

2 酵母菌的酒精發(fā)酵

酵母菌的酒精發(fā)酵如圖2所示。在掌握了EMP途徑后，我們不難發(fā)現(xiàn)酵母菌細胞中酒精的生成來源于EMP途徑中的產(chǎn)物丙酮酸。在丙酮酸脫羧酶（焦磷酸硫胺素為輔酶，并需要Mg2+）的催化下，丙酮酸脫羧生成乙醛和CO2，隨后在乙醇脫氫酶的作用下，乙醛作為受氫體被還原成乙醇。

圖2 酵母菌的乙醇生成機制

因此，葡萄糖生成乙醇的總反應(yīng)式為C6H12O6+2ADP+2H3PO4→2CH3CH2OH+2CO2↑+2ATP。根據(jù)此總反應(yīng)式，1分子葡萄糖在酵母菌細胞內(nèi)進行分解代謝時，可生成2分子乙醇、2分子CO2和2分子ATP。可見，酵母菌進行酒精發(fā)酵生產(chǎn)時，其產(chǎn)能也相對較低。由于葡萄糖和乙醇的相對分子質(zhì)量分別為180.1和46.05，可計算出乙醇的理論轉(zhuǎn)化率為[ ( 2×46.05 )/180.1]×100%=51.1%。

在實際生產(chǎn)過程中，由于5%左右的葡萄糖可以用于酵母菌自身組成成分和其他副產(chǎn)物的合成，因此乙醇對葡萄糖的實際轉(zhuǎn)化率約為理論值的95%。酵母菌的乙醇發(fā)酵是酵母菌進行發(fā)酵的主體產(chǎn)物之一，其在酒類行業(yè)中得以廣泛應(yīng)用，在教學實際中應(yīng)結(jié)合科技前沿予以補充。如郭燕等人從中高溫大曲中分離出了性能優(yōu)良的異常威克漢遜酵母Y1、東方假絲酵母Y2以及釀酒酵母Y3和Y4，經(jīng)過產(chǎn)酒試驗，發(fā)現(xiàn)4株酵母的產(chǎn)酒能力從高到低依次為Y3、Y4、Y1、Y2，該研究為提高小曲酒品質(zhì)和開發(fā)大曲中的微生物資源提供了有效路徑[6]。鄭海武等人從釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)分離得到4株酵母菌，其中WJ1和Q12產(chǎn)酒能力達（10%～11%）vol，與商業(yè)酵母菌產(chǎn)酒能力相當，此外還具有明顯的嗜殺性、低泡性和高絮凝性等，符合國標要求，為本土釀酒酵母的多樣性以及葡萄酒的生產(chǎn)研究提供了理論基礎(chǔ)[7]。

3 酵母菌的甘油發(fā)酵

3.1 亞硫酸鹽法

正常情況下，酵母菌在厭氧條件下代謝流的主體產(chǎn)物為乙醇，該過程相當徹底。如在進行酵母菌的甘油發(fā)酵生產(chǎn)時，加入NaHSO3，乙醛與NaHSO3發(fā)生加成反應(yīng)生成難溶的乙醛加成物，致使乙醇脫氫酶的底物消失，最終導(dǎo)致乙醇無法合成。此時，酵母菌的代謝途徑發(fā)生變化，由磷酸二羥丙酮作為氫受體，并在磷酸甘油脫氫酶的催化下生成磷酸甘油，磷酸甘油繼續(xù)水解生成甘油，如圖3所示。理論上，1分子葡萄糖可生成1分子甘油。然而，在甘油生產(chǎn)的整個代謝過程中并無ATP的積累，因此，酵母菌無法獲得能量從而導(dǎo)致發(fā)酵終止，產(chǎn)物無法生成。為克服這種缺陷，可采取以下措施：（1）厭氧條件下，NaHSO3不能添加太多，保留一部分酒精發(fā)酵，以使酵母菌獲得生命所需的能量；（2）有限供氧，使一部分糖代謝進入TCA循環(huán)，從而有利于酵母菌甘油發(fā)酵，然而由于TCA循環(huán)的存在會產(chǎn)生許多中間代謝物，使得甘油的提純較麻煩。為提高釀酒酵母的甘油產(chǎn)量，康毅等人對釀酒酵母D254發(fā)酵甘油的條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當葡萄糖初始濃度為216 g/L、發(fā)酵溫度32℃、pH為3.0時，發(fā)酵的甘油產(chǎn)量達0.66 mol/L[8]。因此，如果人為改變條件，控制代謝流的方向，可使產(chǎn)物的形成種類發(fā)生改變。這使學生認識到，對內(nèi)在規(guī)律掌握后可熟練進行代謝控制發(fā)酵。

圖3 酵母菌亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵示意圖

3.2 堿法

酵母菌進行酒精發(fā)酵時，如果將發(fā)酵液的pH設(shè)置在7.6以上時，此時代謝流亦會發(fā)生改變。在堿性條件下，此時乙醛不能作為正常的受氫體，因此無法直接被還原成乙醇。然而，2分子乙醛之間可發(fā)生歧化反應(yīng)，相互氧化還原，生成1分子乙醇和1分子乙酸。此外，在另外一條代謝流中，磷酸二羥丙酮作為受氫體，接受3-磷酸甘油醛脫下的氫，進而生成甘油，如圖4所示。因此，2分子葡萄糖在堿法甘油發(fā)酵時，主要產(chǎn)物是2分子甘油、1分子乙醇和1分子乙酸[1]。該法與亞硫酸鹽法相似，整個代謝過程并無ATP的積累，因此需采取一定的措施保障酵母菌自身的生命活動，并生產(chǎn)大量的甘油。

圖4 酵母菌堿法甘油發(fā)酵示意圖

4 其他副產(chǎn)物的生成

酵母菌進行酒精發(fā)酵時，除了主產(chǎn)物乙醇之外，還生成一些雜醇油、酸類、酯類等副產(chǎn)物，多達40余種，其生成機制如表2所示。這些副產(chǎn)物是構(gòu)成白酒、黃酒、葡萄酒等酒類風味的重要組成物質(zhì)，直接影響酒類產(chǎn)品的質(zhì)量。陳玉香等人通過酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃酒，發(fā)現(xiàn)酵母菌可以代謝合成乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯以及乙酸-2-苯乙酯等酯類和苯乙醇、庚醇和丁醇等醇類物質(zhì)，有效提升黃酒的風味品質(zhì)[9]。范光森等人從古井貢酒曲中分離出6株酵母菌，其在發(fā)酵時均可產(chǎn)生乙酸乙酯、異丁酸己酯、3-甲基-1-丁醇、乙酸、苯甲酸等風味成分，表明酵母菌在白酒釀造過程中可有效增強白酒的風味，提升白酒的品質(zhì)[10]。

表2 酵母菌發(fā)酵時副產(chǎn)物的形成機制

5 結(jié)束語

以酵母菌為基本主線，通過人為改變微生物的發(fā)酵條件，改變代謝流，可以控制微生物發(fā)酵的方向和質(zhì)量，使有用的發(fā)酵產(chǎn)品有效積累，是發(fā)酵機理的重要知識點。因此，教師在教學時應(yīng)盡量簡化代謝流，突出重點，結(jié)合科技前沿知識，使抽象的知識具體化、形象化，從而使學生更容易掌握知識點，提升學習品質(zhì)。