大鼠骨髓源性耐受性樹突狀細胞的誘導培養(yǎng)*

馬貴蘭， 譚艷， 包倫敏， 蔣紅梅*

(1.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院 臨床微生物學及免疫學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院 檢驗科， 湖北 武漢 430000)

樹突狀細胞(dendritic cells, DC)是參與調(diào)節(jié)免疫刺激和耐受的重要抗原提呈細胞[1-3]。近年的研究表明，DC的類型不同從而誘導T細胞分化的方向不同，使免疫反應向不同甚至相反的方向發(fā)展，如成熟DC可刺激T細胞的免疫反應性，打破機體自身免疫穩(wěn)態(tài)；未成熟DC因低表達簇分化抗原80(cluster of differentiation 80，CD80)、簇分化抗原86(cluster of differentiation 86，CD86)等可誘導T細胞低反應性或失活，故被稱為“耐受性DC(dendritic cells, tolDC)”[4-6]，這為誘導免疫耐受的建立提供了新方向。寡核苷酸誘騙劑(oligodeoxynucleotides decoy, ODN Decoy)策略是近年來倍受關注的抗基因策略[7]。ODN Decoy與機體內(nèi)一種不可或缺的核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)結(jié)合[8]，導致NF-κB促進靶基因激活被阻止，從而抑制DC成熟而獲得tolDC，且抑制作用具有很高的穩(wěn)定性[9]。臨床上用免疫抑制劑抑制DC成熟的作用弱且不完全，又容易被細胞因子所逆轉(zhuǎn)，而轉(zhuǎn)基因技術往往因腺病毒等載體對DC的刺激作用而抵消導入基因的效應[7]，與免疫抑制劑、轉(zhuǎn)基因技術抑制DC成熟的策略相比，NF-κB寡核苷酸誘騙劑(oligodeoxynucleotides decoy，ODN Decoy)抑制DC成熟所具有的明顯優(yōu)勢，然而DC屬于高分化的非增殖細胞，不能進行傳代培養(yǎng)，其生存時間比較短，數(shù)量極少，體外往往難以獲取到足夠數(shù)量的高質(zhì)量DC[10]。因此，本研究旨在通過NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)tolDC，并對其進行純度、成熟度、細胞活力鑒定以及形態(tài)和耐受性分析，為后續(xù)研究tolDC在機體中免疫抑制機制奠定良好基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物來源 6～7周齡無特殊病原體雄性Sprague Dawley(SD)和Wistar大鼠各10只(體質(zhì)量180～200 g)購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，溫度20～26 ℃、濕度40%～70%的動物飼養(yǎng)室適應飼養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

1.1.2主要試劑和儀器 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白細胞介素4(interleuk-in-4, IL-4；杭州佑研生物)，PE標記的抗大鼠CD80單克隆抗體(PE conjugated anti-rat CD80，PE-CD80)、FITC標記的抗大鼠CD86單克隆抗體(FITC conjugated anti-rat CD86，F(xiàn)ITC-CD86)及Alexa-Fluor 647標記的抗大鼠OX-62單克隆抗體(Alexa-Fluor 647 anti-rat OX-62，Alexa-Fluor 647-OX-62；北京達科為生物)，胎牛血清、大鼠脾臟單個核細胞分離液和4%臺盼蘭溶液(貴州沃爾盛生物)，RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素混合液、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、紅細胞裂解液及吉姆薩原液(貴陽超研生物)，TE2000-U型倒置顯微鏡(日本Nikon)，Navios型流式細胞儀(美國貝克曼)，Series Ⅱ Water Jacket型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛)，NF-κB ODN Decoy參考文獻[11]中使用的序列，正義序列為AGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC，下劃線標出的堿基序列表示與NF-κB特異性結(jié)合的位點，委托上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1DC的制備及分組 參考文獻[12]的方法并根據(jù)實驗需求進行改進，麻醉處死SD大鼠，手術剪剝離脛骨上的組織，剔出脛骨并置于75%酒精的離心管中浸泡5 min，用無菌已制冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗脛骨10次，去除脛骨兩端，用裝有已制冷PBS 10 mL的注射器反復沖洗骨髓腔；將細胞懸液轉(zhuǎn)移到200目過濾器上過濾，細胞懸液1 500 r/min離心5 min，裂解紅細胞，PBS洗滌2次，對獲得的細胞沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸并進行計數(shù)。細胞調(diào)為1×109個/L，將所得細胞懸液于6孔板中鋪板后轉(zhuǎn)移到CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，加適量的預熱PBS靜置漂洗。每孔加RPMI1640完全培養(yǎng)基2 mL，GM-CSF 3×107μg/L，IL-4 2×107μg/L。將DC分為Control-DC組(添加IL-4、GM-CSF定向誘導分化培養(yǎng))、Decoy-DC組(Control-DC組基礎上加5 μmol/L NF-κB ODN Decoy共培養(yǎng))、LPS-DC組(培養(yǎng)初加GM-CSF和IL-4誘導分化培養(yǎng)，第7天加LPS 10 μg/L刺激)及LPS-Decoy-DC組(Decoy-DC組細胞培養(yǎng)至第7天時加10 μg/L LPS) 。培養(yǎng)第3天于6孔板中加RPMI1640完全培養(yǎng)基1 mL/孔，第6天進行半量換液，并補充相應的細胞因子，第8天即可獲得DC。

1.2.2倒置顯微鏡和吉姆薩染色觀察DC形態(tài) 倒置顯微鏡觀察Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓細胞提取當天、培養(yǎng)第4～8天DC及LPS-DC組和LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓細胞培養(yǎng)第8天DC的細胞形狀、體積、表面突起及集落等。收集“1.2.1”項下培養(yǎng)第8天的Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC按吉姆薩染色說明進行染色并觀察DC的形態(tài)特征。

1.2.3檢測DC細胞活力 收集“1.2.1”項下Decoy-DC組SD大鼠骨髓細胞提取當天和培養(yǎng)第8天DC懸液，細胞懸液與染色液(臺盼藍染色法)體積比按9 ∶1混勻(終濃度0.04%)，染色3 min，取1滴染色后的細胞懸液置玻片中央，蓋上蓋玻片后盡快于鏡下觀察并計數(shù)藍色死細胞數(shù)(N1)和無色透明的活細胞數(shù)(N2) ，計算細胞存活率[細胞存活率(%)=N2/(N2+N1)×100%]。

1.2.4檢測DC免疫表型 收集“1.2.1”項下培養(yǎng)至第8天的各組6孔板中4組SD大鼠骨髓來源的DC，DC調(diào)為1×109個/L，PBS清洗后加 PBS 100 μL重懸，加PE-CD80、FITC-CD86及Alexa-Fluor 647-OX-62，4 ℃避光孵育40 min，PBS漂洗、重懸，流式細胞術分別檢測3次獨立培養(yǎng)SD大鼠骨髓DC的免疫表型。

1.2.5淋巴細胞和刺激細胞的制備 麻醉處死Wistar大鼠，迅速取脾臟置于無菌預冷RPMI1640培養(yǎng)基的10 mL離心管，PBS沖洗，Ⅳ型膠原酶消化，200目過濾器過濾，收集細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清后裂解紅細胞，適量含2%胎牛血清的PBS洗細胞1次，通過大鼠脾臟單個核細胞分離液進行分離，取分離出來的單個核細胞用PBS洗2次，將細胞調(diào)為1×109個/L，所得的淋巴細胞即為反應細胞。依次在“1.2.1”項下培養(yǎng)第8天的Control-DC組、Decoy-DC組、LPS-DC組及LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC中加絲裂霉素C 25 mg/L，37 ℃處理30 min，PBS洗3遍，將DC調(diào)為2×108個/L作為刺激細胞。

1.2.6混合淋巴細胞反應 混合淋巴細胞反應試驗分為空白對照組(單獨加淋巴細胞)、Control-DC組、Decoy-DC組、LPS-DC組及LPS-Decoy-DC組。調(diào)整刺激細胞與反應細胞比例為1 ∶5，依次在96孔板中分別加上述處理刺激細胞和反應細胞(100 μL/孔)，每組中分別作相互獨立的6孔重復。37 ℃培養(yǎng)68 h，加臨用時配置的噻唑藍20 μL/孔后培養(yǎng)4 h，棄上清，加二甲基亞砜100 μL/孔稍振蕩待產(chǎn)物充分溶解，酶標儀上測490 nm處光密度(optical density，OD490)值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DC組織學觀察

SD大鼠骨髓細胞提取當天呈單個核細胞形態(tài)，第4天形態(tài)明顯變化，第8天Control-DC組SD大鼠骨髓DC集落較Decoy-DC組大，LPS作用Control-DC組SD大鼠骨髓DC后發(fā)現(xiàn)DC細胞集落變小、表面突起增多且明顯多于其他組，但Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC形態(tài)無明顯差異、表面突起較少見(圖1)；收集培養(yǎng)第8天的Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC進行吉姆薩染色，Control-DC組DC周邊典型突起清晰可見，且較Decoy-DC組突起長而大(圖2)。

注：A、C、E為Decoy-DC組，B、D、F為Control-DC組，G為LPS-Decoy-DC組，H為LPS-Control-DC組圖1 SD大鼠骨髓不同培養(yǎng)時期的DC(200×)Fig.1 DC of SD rat bone marrow in different culture periods(200×)

Decoy-DC組 Control-DC組圖2 SD大鼠骨髓DC吉姆薩染色(1 000×)Fig.2 Giemsa staining of DC derived from SD rat bone marrow(1 000×)

表1 Wistar大鼠脾臟淋巴細胞和SD大鼠骨髓源性DC混合淋巴細胞反應Tab.1 Mixed lymphocyte reaction of Wistar rat spleen lymphocytes and SD rat bone

2.2 DC細胞活力評估

Decoy-DC組SD大鼠骨髓細胞剛提取單個核細胞和培養(yǎng)至第8天的DC臺盼藍染色結(jié)果顯示未被臺盼藍染色的活細胞均>95%，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC臺盼藍染色的細胞活力觀察(100×)Fig.3 Observation on cell viability of SD rat bone marrow DC stained with trypan blue in Decoy-DC group(100×)

2.3 DC表面OX-62的表達

4組SD大鼠骨髓DC的OX-62陽性表達率為95%～100%，平均98.225%，但各組DC間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為DC表面OX-62表達的流式細胞儀檢測結(jié)果，B為DC表面OX-62的定量表達。圖4 SD大鼠骨髓DC特異性標志OX-62流式細胞術結(jié)果Fig.4 Flow cytometry results of SD rat bone marrow DC specific marker OX-62

2.4 DC表面CD80和CD86表達

Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC的CD80、CD86陽性率和平均熒光強度低于Control-DC組(P<0.05)，LPS-DC組SD大鼠骨髓DC的CD80、CD86陽性率和平均熒光強度高于LPS-Decoy-DC組(P<0.05)。見圖5。

注：A為DC表面CD80和CD86表達的流式細胞儀檢測結(jié)果，B和C分別為DC表面CD80和CD86平均熒光強度的定量結(jié)果，D和E分別為DC表面CD80和CD86陽性率的定量結(jié)果；(1)與Control-DC組比較，P<0.05；(2)與LPS-DC組比較，P<0.05。圖5 SD大鼠骨髓DC表面CD80和CD86表達Fig.5 Expression of CD80 and CD86 on the surface of SD rat bone marrow DC

2.5 淋巴細胞增殖

Decoy-DC組Wistar大鼠脾臟淋巴細胞和SD大鼠骨髓源性的DC混合淋巴細胞OD490低于Control-DC組(P<0.05)；Decoy-DC組經(jīng)LPS作用，Wistar大鼠脾臟淋巴細胞和SD大鼠骨髓源性的DC混合淋巴細胞OD490增高，但仍低于LPS-DC組(P<0.05)。見表1。

3 討論

DC是免疫系統(tǒng)的關鍵調(diào)節(jié)成分，來源于骨髓造血祖細胞，可精確、特異地指導免疫系統(tǒng)對抗原的反應，也是宿主免疫反應的組成部分，被認為是免疫應答的典型前哨細胞,在先天性免疫和適應性免疫之間發(fā)揮著橋梁的作用，是近年來研究的熱點[13-16]。目前研究中，提取大鼠DC主要源于骨髓和外周血，雖然外周血與骨髓相比取材較方便，但是獲取的DC純度低[17]，因此相關研究中仍以骨髓來源的DC較為多見。課題組前期培養(yǎng)脾臟來源DC純度低[7]，方法經(jīng)改良后純度明顯增加[18]。考慮臨床上將病人自身來源的DC進行改造后用于自體輸注治療的嘗試，與獲取病人脾臟來源的tolDC相比，骨髓源性tolDC具有以下優(yōu)勢：(1)對患者創(chuàng)傷性更?。?2)對實驗人員的要求不高、操作簡單且容易獲取大量的高純度的DC；(3)安全性高；(4)患者接受可能性更高；(5)更具有向臨床上推廣的可行性。雖然運用磁珠分選能夠獲得足夠數(shù)量的高純度的DC，但成本較高[11]。因此本實驗著眼于利用DC前體細胞暫時貼壁特性來分離獲取SD大鼠骨髓來源的單個核細胞，并用 NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)為tolDCs。

細胞因子(GM-CSF和IL-4)在單個核細胞定向誘導分化為DC的過程中發(fā)揮了重要作用[19-20]。GM-CSF是培養(yǎng)DC誘導其分化的根本，在誘導培養(yǎng)體系中單個核細胞定向轉(zhuǎn)化為DC過程中起重要作用[21]，IL-4能夠抑制培養(yǎng)細胞群中單個核細胞向巨噬細胞、中性粒細胞分化，使DC處于未成熟階段，具備處理抗原的功能，促進DC表面共刺激分子的表達[22]。與此同時IL-4可促進誘導生成DC，從而增加DC產(chǎn)量和純度[23]。成熟DC比未成熟DC更容易形成集落[10]，同時成熟DC在掃描電鏡中比未成熟DC表面有更多細且長的毛發(fā)樣突起，該突起可能跟DC的抗原攝取遞呈能力有關，即細且長的突起更容易將抗原呈遞給T細胞[18]。本實驗中培養(yǎng)至第8天時，Control-DC組、Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC的鏡下形態(tài)和吉姆薩染色結(jié)果分別與文獻中描述的成熟DC、未成熟DC典型形態(tài)基本吻合，表明NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)出DC呈未成熟狀態(tài)。研究表明LPS可刺激DC成熟，細胞培養(yǎng)到第7天，此時的細胞基本被誘導為DC，LPS作為一種刺激劑，刺激細胞后可促進其成熟，本實驗為了觀察用NF-κB ODN Decoy處理的Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC耐受狀態(tài)是否穩(wěn)定，故在細胞培養(yǎng)的第7天加LPS進行短期刺激，第8天觀察可見LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC形態(tài)未發(fā)生顯著改變，表明NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)出DC對LPS刺激表現(xiàn)了一定穩(wěn)定性。

細胞活性測定是至關重要的，決定培養(yǎng)的細胞能否進行下一步實驗。臺盼藍一直是染色死細胞以測定細胞活力的金標準[24]。這種染料被膜完整的活細胞排除在外，但可以進入并集中在膜受損的死細胞中，使細胞呈深藍色[24]。從臺盼藍染色情況來看，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC提取當天和培養(yǎng)第8天細胞活力均>95%，說明NF-κB ODN Decoy不影響DC活力，滿足實驗要求。此結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果類似，表明骨髓和脾臟均可誘導獲得高活力的tolDCs。

本實驗誘導培養(yǎng)的DC不僅具有DC的形態(tài)成熟和未成熟時的特點，同時在細胞細胞表面分子表型也符合DC及成熟度的特點[23]。OX-62是DC中一種相對特異性抗原，主要表達在大鼠DC表面，雖然除DC以外也有其他細胞表達，但由于其含量甚少，故目前仍把OX-62作為特異性標志來檢驗DC[25]。SD大鼠骨髓來源的4組DC OX-62表達均>95%且組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明骨髓可誘導出高純度的DC且NF-κB ODN Decoy對DC OX-62表達不產(chǎn)生影響。研究表明，DC的功能成熟與表面共刺激分子(如CD80、CD86及CD40等)有關[26]。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與Control-DC組相比，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC CD80、CD86陽性率和平均熒光強度下調(diào)，是一種相對不成熟的細胞表型特征即耐受狀態(tài)。在細胞培養(yǎng)的第7天加LPS刺激，第8天可見，與LPS-DC組相比，LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC CD80、CD86陽性率和平均熒光強度上調(diào)不明顯，說明NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)的SD大鼠骨髓DC具有一定的穩(wěn)定性。此外，與Control-DC組相比，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DCOD490降低，表明Decoy-DC組tolDC致淋巴細胞增殖程度降低，LPS作用后OD490略有升高，表明LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC致淋巴細胞增殖程度不顯著，表明NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)的SD大鼠骨髓DC具有一定的致耐受性。

綜上所述，本研究表明利用NF-κB ODN Decoy誘導培養(yǎng)可獲得大量SD大鼠骨髓源性的高純度、高活力、形態(tài)及表型均表現(xiàn)耐受特性的穩(wěn)定的tolDC，確保實驗的可行性，可為后續(xù)進一步研究tolDC的功能特性奠定堅實的相關實驗基礎以及為免疫耐受方面的研究提供提供基礎數(shù)據(jù)和細胞材料。