類姜黃素-芳基釕配合物的合成、結(jié)構(gòu)和光照激活抗癌活性

蔣憲濤 王曉輝 李培源 蘇 煒＊,

(1南寧師范大學(xué)，廣西天然高分子化學(xué)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

(2廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

0 引言

近年來，金屬有機(jī)配合物因其對(duì)不同癌細(xì)胞的特異性活性以及良好的細(xì)胞毒性而成為科研工作者的研究熱點(diǎn)[1-2]。其中，釕離子由于其多變的氧化態(tài)，在生命體內(nèi)可以像鐵離子一樣進(jìn)入代謝循環(huán)，幾乎不顯毒性，因此釕配合物成為非常有應(yīng)用潛力的新型抗癌藥物[3]。例如[HIm][trans-RuCl4(DMSO)(Im)](NAMI-A)和[ImH][trans-RuCl4(Im)2](KP1019)已經(jīng)成功進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗(yàn)[4-6]。此外，分子式為[(η6-arene)Ru(X)(Y)(Z)]的半三明治型芳基釕配合物由于其特殊的分子構(gòu)型及其在抗癌研究中的作用，也引起了越來越多的關(guān)注。如Sadler課題組報(bào)道的[(η6-bip)Ru(en)Cl]PF6(en=乙二胺)表現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤細(xì)胞抑制活性[7-8]，Dyson 課 題組 報(bào)道 的[(η6-cymene)Ru(PTA)Cl2](PTA=1，3，5-三氮雜-7-磷金剛烷)則表現(xiàn)出良好的抗轉(zhuǎn)移活性[9-10]。在這些配合物中，配體X、Y和Z的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)對(duì)配合物的抗癌活性起著至關(guān)重要的作用[11-16]。

作為一類β-二酮配體，姜黃素及其衍生物(curcuminoids，Curc)以其抗炎、抗菌和抗腫瘤等廣譜的生物活性而受到人們的廣泛關(guān)注[17]。Caruso課題組報(bào)道了系列含類姜黃素配體的芳基釕配合物[(η6-cymene)Ru(Curc)Cl]，并發(fā)現(xiàn)這些配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞有很好的抑制活性[18]。Dyson課題組在芳基釕-類姜黃素配合物中引入PTA配體，獲得了具有良好抗癌選擇性的芳基釕配合物[(η6-cymene)Ru(Curc)(PTA)]PF6[19]。此外，類姜黃素及金屬配合物的光譜和光化學(xué)性質(zhì)具有一個(gè)重要特性：在波長為410～430 nm的光譜有強(qiáng)烈的吸收[20]。這一特性使得此類化合物具備光敏性，可利用光照來增強(qiáng)其抗癌活性[21]。Kondaiah課題組報(bào)道了含姜黃素配體的鉑配合物[Pt(Curc)(NH3)2]NO3，其在光照下細(xì)胞毒性比避光條件下提高13倍[22]。Renfrew課題組報(bào)道了一系列可在有氧和無氧環(huán)境下激活的含姜黃素配體的鈷配合物，其細(xì)胞光毒性比避光條件下提高20倍[23]。為了延續(xù)本課題組先前對(duì)芳基釕-類姜黃素配合物的探索，我們合成了3種新型的芳基釕-類姜黃素-PTA配合物[24]，通過核磁共振、質(zhì)譜、單晶衍射等方法表征了它們的結(jié)構(gòu)，通過MTT法研究其抗癌活性，并利用光照對(duì)其細(xì)胞光毒性進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用溶劑均采用國產(chǎn)分析純?cè)噭┎⒃谑褂们斑M(jìn)行純化。[(p-cymene)RuCl2]2和其他試劑購自百靈威試劑公司,類姜黃素配體(L1～L3)均通過文獻(xiàn)方法制備[24]。1H NMR采用Bruker AV-600(德國)核磁共振波譜儀以600 MHz的頻率測(cè)定；HR-ESI-MS使用Waters UPLC XEVO G2 TOF質(zhì)譜儀測(cè)定；C、H、N元素分析使用Elementar Vario EL Cube元素分析儀測(cè)定；UV-Vis使用Cary 100紫外可見分光光度計(jì)(澳大利亞安捷倫科技有限公司)測(cè)定；熒光光譜使用Thermo熒光光譜儀(美國)測(cè)定；單晶結(jié)構(gòu)使用Bruker SMART CCD X射線單晶衍射儀測(cè)定。

1.2 配合物1～3的合成

配合物1～3的合成過程如Scheme 1所示。

Scheme 1 Synthesis of complexes 1～3

1.2.1 配合物[(η6-p-cymene)Ru(L1)(PTA)]PF6(1)的合成

將[(η6-p-cymene)RuCl2]2(31 mg，0.05 mmol)、配體L1(27.6 mg，0.1 mmol)和NaOEt(10.2 mg，0.15 mmol)溶解在6 mL乙醇中。室溫?cái)嚢? h，加入AgPF6(25.7 mg，0.1 mmol)后繼續(xù)攪拌2 h。過濾以除去AgCl沉淀，在濾液中加入PTA(15.7 mg，0.1 mmol)，室溫?cái)嚢?4 h，析出暗紅色固體，通過CH2Cl2/正己烷重結(jié)晶進(jìn)行進(jìn)一步純化(50.0 mg，產(chǎn)率62%)。元素分析(%，括號(hào) 內(nèi)為 按 C35H41F6N3O2P2Ru·1/4CH2Cl2計(jì) 算值)：C 50.94(50.77)，H 4.99(5.02)，N 5.04(5.04)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.685(d，J=6.0 Hz，4H)，7.477～7.425(m，8H)，6.903(d，J=16.2 Hz，2H)，6.133(dd，J=32.4，5.4 Hz，4H)，5.950(s，1H)，4.474(dd，J=28.8，12.6 Hz，6H)，4.138(s，6H)，2.690(dd，J=13.8，6.6 Hz，1H)，2.038(s，3H)，1.300(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實(shí)測(cè)值(理論值)：668.199 8(668.199 0)。

1.2.2 [Ru(η6-p-cymene)(L2)(PTA)]PF6(2)的合成

合成步驟同1。產(chǎn)量56 mg，產(chǎn)率66%。元素分析(%,括號(hào)內(nèi)為按C35H39F8N3O2P2Ru·H2O計(jì)算值)：C 48.55(48.50)，H 4.89(4.77)，N 4.99(4.85)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.766(dd，J=8.4，5.4 Hz，4H)，7.440(d，J=16.2 Hz，2H)，7.300(t，J=9.0 Hz，4H)，6.861(d，J=15.9 Hz，2H)，6.123(dd，J=28.8，5.4 Hz，4H)，5.903(s，1H)，4.447(q，J=26.4，12.6 Hz，6H)，4.128(s，6H)，2.683～2.637(m，1H)，2.028(s，3H)，1.289(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實(shí)測(cè)值(理論值)：704.179 6(704.180 1)。

1.2.3 [Ru(η6-p-cymene)(L3)(PTA)]PF6(3)的合成

合成步驟同1。產(chǎn)量43 mg，產(chǎn)率49%。元素分析(%,括號(hào)內(nèi)為按C37H45F6N3O4P2Ru·5/4H2O計(jì)算值)：C 49.50(49.64)，H 5.10(5.35)，N 4.92(4.69)，1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.631(d，J=6.4 Hz，4H)，7.409(d，J=15.6 Hz，2H)，7.016(d，J=9.0 Hz，4H)，6.742(d，J=15.6 Hz，2H)，6.133(dd，J=34.2，5.4 Hz，4H)，5.845(s，1H)，4.440(q，J=22.8，12.6 Hz，6H)，4.120(s，6H)，3.819(s，6H)，2.687～2.641(m，1H)，2.030(s，3H)，1.293(d，J=6.6 Hz，6H)。HR-ESI-MS(DMSO)：[1-PF6-]+m/z實(shí)測(cè)值(理論值)：728.220 1(728.220 2)。

1.3 結(jié)構(gòu)測(cè)定

配合物1～3的單晶測(cè)試是在293 K下用石墨單色化MoKα射線(λ=0.071 073 nm)于單晶衍射儀上，進(jìn)行衍射點(diǎn)數(shù)據(jù)收集。利用直接法解出結(jié)構(gòu)，并混合加氫，氫原子采用各向同性熱參數(shù)。非氫原子采用各向異性熱參數(shù)。結(jié)構(gòu)經(jīng)全矩陣最小二乘法修正，用SHELXL2016[25-26]和OLEX.2程序包分別進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析和結(jié)構(gòu)修正。配合物1～3的單晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)見表1，配合物1～3的部分鍵長、鍵角數(shù)據(jù)見表2。

表1 配合物1～3的晶體數(shù)據(jù)Table 1 Crystal data collection for 1～3

續(xù)表1

表2 配合物1～3的鍵長(nm)和鍵角(°)Table 2 Selected bond lengths(nm)and angles(°)in complexes 1～3

CCDC：1514601，1；1514600，2；1514603，3。

1.4 配合物的抗癌活性

本研究所使用的人肝癌細(xì)胞(HepG2)來自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。細(xì)胞在含10%的血清培養(yǎng)基RPMI-1640中生長。用MTT法測(cè)定配合物對(duì)癌細(xì)胞體外抗增殖活性：取對(duì)數(shù)期生長的癌細(xì)胞，配成細(xì)胞懸液，加入 96 孔板，每孔(200 μL)1×104～3×104個(gè)細(xì)胞，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;采用MTT法，每孔加入1 μL不同濃度的藥物，控制藥物終濃度分別為10、20、30、50、60、80 μmol·L-1，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，癌細(xì)胞在λ＞400 nm，功率密度為30 mW·cm-2的條件光照30 min，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL(5 mg·mL-1)MTT，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸掉上清液，每孔加入100 μL的DMSO，置于搖床上低速震蕩，10 min后使用酶標(biāo)儀上測(cè)量492 nm波長處OD值。每種藥物重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，每次做3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算配合物對(duì)癌細(xì)胞的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成與表征

配合物1～3均采用相同的方法合成：在室溫下將[(η6-p-cymene)RuCl2]2與相應(yīng)的類姜黃素配體反應(yīng)后，加入AgPF6除去Cl-，再加入PTA進(jìn)一步反應(yīng)合成得到。用核磁共振波譜、高分辨質(zhì)譜、元素分析等手段對(duì)1～3進(jìn)行了表征。其中，高分辨質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)測(cè)得配合物1～3的m/z峰值分別為668.199 8、704.179 6和728.220 1，相對(duì)應(yīng)的正離子分別為[(η6-p-cymene)Ru(L1)(PTA)]+、[(η6-p-cymene)Ru(L2)(PTA)]+和[(η6-p-cymene)Ru(L3)(PTA)]+，與配合物1～3的陽離子相吻合。

將配合物1～3配成濃度為20 μmol·L-1的DMSO溶液，研究其UV-Vis光譜。從圖1可以看到，這些配合物在310～510 nm區(qū)域有明顯的吸收，該吸收峰主要?dú)w因于配體以及金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移(1MLCT)[27]。配合物1和2的吸收光譜相似，其最大吸收峰位于375 nm，配合物3的最大吸收峰位于411 nm，相對(duì)于1和2明顯紅移。這是由于配體L3端位上的供電子基團(tuán)OCH3導(dǎo)致。

圖1 配合物1～3在DMSO中的紫外可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra for complexes 1～3 in DMSO

2.2 配合物的晶體結(jié)構(gòu)

配合物1～3的單晶結(jié)構(gòu)如圖2～4所示。配合物1和2屬于單斜晶系的C2/c空間群，配合物3的晶體屬于三斜晶系P1空間群。3個(gè)配合物具有相似結(jié)構(gòu)，其中心金屬釕（Ⅱ）離子與甲基異丙基苯配體中的苯環(huán)以η6形式配位，與類姜黃素配體以O(shè)，O螯合配位，與PTA配體中的P原子以單齒配位，形成六配位八面體結(jié)構(gòu)的一價(jià)陽離子。甲基異丙基苯配體中的苯環(huán)中心與釕離子之間的距離分別為0.170 71(9)、0.173 31(8)、0.170 95(3)nm。另外 3個(gè)配位鍵鍵 長 為 Ru1—P1 0.231 7～0.232 6 nm、Ru1—O1 0.205 6～0.206 7 nm、Ru1—O2 0.207 0～0.207 6 nm，表明3個(gè)配合物的結(jié)構(gòu)非常相似。C1—C2和C1—C2′的鍵長在0.140 8～0.150 0 nm范圍，該長度處于單鍵鍵長和雙鍵鍵長之間，這是由配體中β-二酮的部分形成去質(zhì)子化螯合配體后主要以(—O—C—C—O—)形式共振而導(dǎo)致。圍繞金屬釕離子的鍵角為 O1—Ru1—O2 87.83°～88.76°、O1—Ru1—P1 85.77°～86.71°、O2—Ru1—P1 85.95°～86.06°，與之前報(bào)道的類似配合物數(shù)值接近[24]。

圖2 配合物1的30%概率橢球晶體圖Fig.2 ORTEP of 1 with thermal ellipsoids probabilityof 30%

圖3 配合物2的30%概率橢球晶體圖Fig.3 ORTEP of 2 with thermal ellipsoids probability of 30%

圖4 配合物3的30%概率橢球晶體圖Fig.4 ORTEP of 3 with thermal ellipsoids probability of 30%

2.3 配合物的細(xì)胞活性測(cè)試

類姜黃素-芳基釕配合物1～3對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的體外抗腫瘤活性見表3。結(jié)果顯示，在避光條件下，配合物1和2對(duì)HepG2細(xì)胞均未表現(xiàn)出抗腫瘤活性，配合物3對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出一定抗腫瘤活性，IC50值為(60.3±1.1)μmol·L-1。顯然，相對(duì)于吸電子基團(tuán)(配合物1和2中的H和F原子)，類姜黃素配體端位的供電子基團(tuán)(配合物3中的—OCH3)對(duì)此類配合物的HepG2細(xì)胞增殖抑制活性影響更為正面。使用λ＞400 nm的光照射30 min后，配合物1仍未顯示出抗腫瘤活性，但配合物2和3對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制活性得到明顯提高，其IC50值分別降低 為 (60.1±1.0) μmol·L-1和 (45.0±6.1) μmol·L-1。這說明利用光照作用，可以有效提高類姜黃素-芳基釕配合物的抗腫瘤活性，這可能是由于配合物在光照后產(chǎn)生活性氧[22]，從而提高了配合物的細(xì)胞毒性。因此，雖然這3個(gè)配合物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制活性較為溫和，但是本研究對(duì)于此類配合物的構(gòu)效關(guān)系研究和提高其使用效率具有一定的參考價(jià)值。

表3 配合物1～3對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的IC50值(λ＞400 nm)Table 3 IC50values(λ＞400 nm)of 1～3 against HepG2 cancer cell lines

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)、合成了3種新型類姜黃素-芳基釕配合物1～3。并通過單晶X射線衍射實(shí)驗(yàn)，對(duì)比研究了這3個(gè)配合物的結(jié)構(gòu)。在避光條件下，配合物1和2對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞不顯活性，而配合物3表現(xiàn)出一定的活性，原因可能是相對(duì)于吸電子基團(tuán)的H原子和F原子，類姜黃素配體端位苯環(huán)上的供電子基團(tuán)—OCH3更有利于配合物對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制活性。光照后(λ＞400 nm)，除配合物1外，2和3對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制活性都有明顯提高，說明光照可以有效提高此類配合物的抗腫瘤活性。本研究為進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成新型高效抗癌芳基配合物提供了一定的理論基礎(chǔ)。