UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)蔬菜中三種殺菌劑殘留的研究

黃麗, 鄧毅書(shū), 浦恩堂, 代雪芳, 李文希

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 昆明 650201; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所, 昆明 650205)

蔬菜中的農(nóng)藥殘留是一個(gè)社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題，農(nóng)藥殘留不僅對(duì)人體健康和環(huán)境帶來(lái)潛在危害，引發(fā)社會(huì)對(duì)食品安全的恐慌，還對(duì)我國(guó)的農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易產(chǎn)生極大影響[1]，因此食品中的農(nóng)藥檢測(cè)顯得尤其重要。烯酰嗎啉(dimethomorph)是一種羧酸酰胺類(lèi)真菌殺菌劑，化學(xué)式為C21H22ClNO4；霜脲氰(cymoxanil)是一種脲類(lèi)殺菌劑，化學(xué)式為 C7H10N4O3；唑嘧菌胺(ametoctradin)是一種三唑嘧啶類(lèi)殺菌劑，化學(xué)式為C15H25N5。這三種殺菌劑主要用于防治卵菌病害，對(duì)馬鈴薯、番茄、茄子等蔬菜的卵菌病害具有優(yōu)良的治療作用，因此廣泛應(yīng)用于蔬菜晚疫病、霜霉病等疾病的防治。

目前，烯酰嗎啉的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)[2-3]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[4-5]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS)[6]，霜脲氰的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(UPLC)[7-8]，唑嘧菌胺的檢測(cè)方法有超高效液相色譜法(UPLC)[9]，這些方法大多前處理?xiàng)l件復(fù)雜，凈化條件苛刻，耗時(shí)長(zhǎng)且成本高。并且，因烯酰嗎啉、霜脲氰、唑嘧菌胺復(fù)配使用能減少抗性，通常以復(fù)配的形式在蔬菜中使用，所以單一農(nóng)藥檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿足快速檢測(cè)要求，而食品中農(nóng)藥最大殘留限量(GB 2763—2019)[10]中也沒(méi)有規(guī)定唑嘧菌胺的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。本研究基于 UPLC-MS/MS技術(shù)，旨在優(yōu)化前處理技術(shù)，建立一種能同時(shí)快速檢測(cè)蔬菜基質(zhì)中烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的分析方法，為其快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。經(jīng)研究證明，該方法準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度均符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)測(cè)(NY/T 788—2018)[11]的要求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品：選取當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)售賣(mài)的馬鈴薯、茄子、蘿卜和西紅柿為代表性蔬菜，取可食部分用破壁機(jī)打碎。

儀器：Waters Xevo TQD三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Waters公司)；AE100電子分析天平(梅特勒公司)；PL620-S電子天平(梅特勒公司)；TARGIN VXIII多管渦旋振蕩儀；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機(jī)(上海飛鴿)；1-14臺(tái)式小型離心機(jī)(希格瑪公司)；破壁機(jī)(沃健佳)。

試劑：純度96.2%的烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品(常隆公司)；純度99.9%的霜脲氰標(biāo)準(zhǔn)品(Dr公司)；純度99.7%的唑嘧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品(Dr公司)；色譜純甲醇、乙腈(Merck公司)；優(yōu)級(jí)純甲酸(安普公司)；分析純MgSO4、NaCl(國(guó)藥公司)；C18、N-丙基乙二胺(PSA)(上海斯信生物科技公司)、石墨化碳(Agilent公司)、蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取烯酰嗎啉標(biāo)準(zhǔn)品0.010 4 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱(chēng)取霜脲氰標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱(chēng)取唑嘧菌胺標(biāo)準(zhǔn)品0.010 1 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 007 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，5 ℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取上述各儲(chǔ)備液1 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成100.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后按照此方法逐步稀釋為10.0、1.0、0.1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃下保存。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取900 μL乙腈于2 mL離心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL離心管中，后用乙腈逐級(jí)稀釋為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取900 μL空白基質(zhì)凈化液于2 mL離心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL離心管中，后用空白基質(zhì)凈化液逐級(jí)稀釋成1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以添加回收率為指標(biāo)，添加回收率越接近100%，效果最好[11]。設(shè)置乙腈(A1)、1∶1的乙腈-0.1%甲酸水(A2)、1∶1的乙腈-水(A3)、甲醇(A4)共4種不同提取劑，以及5 g NaCl(B1)、2.5 g NaCl+2 g MgSO4(B2)、5 g MgSO4(B3)、4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)、4.5 g NaCl+0.5 g MgSO4(B5)共5種不同配比的鹽析材料，考察不同提取劑和不同鹽析材料的提取效率。設(shè)置C18+GCB(C1)、C18(C2)、C18+PSA(C3)、GCB+PSA(C4)、PSA(C5)、GCB(C6)、C18+PSA+GCB(C7)共7種組合凈化劑，比較分析不同凈化劑的凈化效率。綜合提取劑、鹽析材料和凈化劑的最佳組合，在空白樣品中添加了0.005、0.05、0.5、1.0 mg·kg-14個(gè)濃度的混合農(nóng)藥溶液，做5次平行回收試驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，通過(guò)考察烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺在蔬菜基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限和基質(zhì)效應(yīng)對(duì)所建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

采用相對(duì)響應(yīng)值法對(duì)基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)做出評(píng)價(jià)?；|(zhì)效應(yīng)計(jì)算公式如下。

ME=B/A×100%

式中，B指目標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積之和，A指目標(biāo)物在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積之和。

ME>100%，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<100%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；80%

1.3.2樣品處理 稱(chēng)取5.0 g打碎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取5 min，加入4 g NaCl+1 g MgSO4，振蕩1 min，3 000 r·min-1離心5 min。取上清液1 mL于裝有50 mg C18的2 mL的離心管中，渦旋混勻3 min，14 700 r·min-1離心3 min。取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

1.3.3UPLC-MS/MS檢測(cè)條件 色譜分析條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，樣品室溫度為室溫，進(jìn)樣體積為1 μL，流速為0.4 mL·min-1，流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

質(zhì)譜分析條件：質(zhì)譜電子轟擊離子源為ESI，正離子模式(ES+)掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)進(jìn)行數(shù)據(jù)掃描；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣流速溫度為350 ℃；脫溶劑氣流速800 L·h-1；毛細(xì)管電壓2.9 kV；錐孔氣速50 L·h-1，通過(guò)對(duì)毛細(xì)管電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)的最佳優(yōu)化，最終確定烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定性和定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)質(zhì)譜條件(表2)。

表2 3種農(nóng)藥MRM模式下的檢測(cè)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇 從不同提取溶劑的回收率(圖1)可以看出，當(dāng)提取溶劑為乙腈(A1)時(shí)，3種化合物的回收率在92.7%～102%之間，由于乙腈的極性范圍廣，對(duì)樣品基質(zhì)有較強(qiáng)的滲透作用，提取的色素雜質(zhì)少，有助于后期的鹽析和凈化。提取溶劑為0.1%甲酸水-乙腈(A2)和乙腈-水(A3)時(shí)，烯酰嗎啉和霜脲氰兩種目標(biāo)物的提取效率大于260%，大大超出了回收率的限值，可能是因?yàn)樗臉O性范圍廣，提取目標(biāo)物的過(guò)程中也能提取到一些其他雜質(zhì)，對(duì)儀器分析帶來(lái)干擾，最終影響目標(biāo)化合物的定性和定量。采用甲醇(A4)作為提取溶劑時(shí)，其回收率為62%～72%，回收率太低。因此，選取乙腈為3種混合農(nóng)藥的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)3種殺菌劑的提取效率

2.1.2鹽析材料的選擇 在鹽析輔助均相液相萃取中最常用的鹽是NaCl和MgSO4。但因Mg2+的離子電位高，水相的離子強(qiáng)度大，而NaCl與目標(biāo)物存在相互作用，常常影響萃取效率[13]。因此，本研究比較了不同配比鹽析材料的除水效果，不同處理的回收率結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)，當(dāng)使用5 g NaCl(B1)作為鹽析材料時(shí)，烯酰嗎啉的回收率可達(dá)到110%，當(dāng)使用5 g MgSO4(B3)作為鹽析材料時(shí)，霜脲氰的回收率可達(dá)到128%，偏高；當(dāng)使用2.5 g NaCl+ 2.5 g MgSO4(B2)作為鹽析材料時(shí)，唑嘧菌胺的回收率偏低，僅有81%。綜合三種目標(biāo)物的回收率，最終選取4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)作為鹽析材料。

圖2 不同鹽析材料對(duì)農(nóng)藥回收率的影響

2.1.3凈化劑的選擇 快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、可靠和安全等特點(diǎn)已成為現(xiàn)在國(guó)際上主要的凈化技術(shù)研究方向，吸附材料主要是通過(guò)離子相互作用、非極性相互作用、極性相互作用等選擇性地去除和保留基質(zhì)中的干擾成分，從而實(shí)現(xiàn)凈化的目的[12]。不同凈化劑的回收率結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)，當(dāng)采用PSA(C5)作為凈化劑時(shí)，烯酰嗎啉的回收率偏高，但采用GCB(C6)作為凈化劑時(shí)，烯酰嗎啉和霜脲氰的回收率均太低，只有采用C18(C2)作為凈化劑時(shí)，3種目標(biāo)化合物的回收率均在96.4%～101%之間，達(dá)到最理想的效果。因此，本研究最終選取C18作為最終的凈化材料。

圖3 不同凈化劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指提取基質(zhì)中的目標(biāo)物時(shí)，基質(zhì)中的干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化，使得目標(biāo)化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生了增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象。為提高目標(biāo)化合物的測(cè)定準(zhǔn)確度，需要對(duì)不同基質(zhì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)做出評(píng)價(jià)，并選擇合適的方法減小基質(zhì)效應(yīng)的干擾[14]。對(duì)3種藥劑在蔬菜中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果(表3)顯示，基質(zhì)效應(yīng)在94.22%～108.74%范圍內(nèi)[12]，因此該基質(zhì)效應(yīng)可忽略。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系和定量限 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行回歸分析。3種目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)，在0.001～1.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，3種目標(biāo)化合物在不同基質(zhì)中的相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 0，線性關(guān)系良好，說(shuō)明在該測(cè)定條件下3種農(nóng)藥檢測(cè)結(jié)果是可信的。取信噪比S/N=10確定定量限，烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均為0.005 mg·kg-1。

表3 3種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系和定量限

2.3.2回收率和精密度 添加不同分析物濃度的馬鈴薯、西紅柿、茄子和蘿卜測(cè)得的回收率結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，烯酰嗎啉在蔬菜中的平均加標(biāo)回收率為87.3%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～11.0%；霜脲氰在蔬菜中的平均加標(biāo)回收率為85.4%～113.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～10.9%；唑嘧菌胺在蔬菜中的平均添加回收率為80.9%～108.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～10.2%。結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求[11]。

表4 3種目標(biāo)物在蔬菜基質(zhì)中的添加回收率均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 討論

本研究通過(guò)超高液相色譜分離和串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，優(yōu)化了提取劑、鹽析材料和吸附劑的組合，簡(jiǎn)化了前處理步驟，降低了樣品基質(zhì)的干擾，保證了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，樣品經(jīng)乙腈提取，十八烷基硅烷(C18)分散固相萃取凈化，HSS T3色譜柱分離待測(cè)物，甲醇-0.1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，正負(fù)離子分段掃描和多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)檢測(cè)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，其精密度、準(zhǔn)確度和靈敏度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。

通過(guò)取10倍信噪比來(lái)確定定量限，烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均為0.005 mg·kg-1，根據(jù)中國(guó)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB2763—2019)[10]標(biāo)準(zhǔn)，烯酰嗎啉在蔬菜類(lèi)中的最大殘留限量(MRL)值最小為0.05 mg·kg-1，霜脲氰在蔬菜類(lèi)中的MRL值最小為0.2 mg·kg-1，唑嘧菌胺在蔬菜類(lèi)中的MRL值最小為0.05 mg·kg-1。因此，該方法的靈敏度能滿足烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺檢測(cè)需要。

該方法具有基質(zhì)干擾小、高通量、萃取效率高、操作簡(jiǎn)單、分析快、溶劑用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，滿足農(nóng)殘檢測(cè)分析中高效率、高通量、低成本的要求，能為蔬菜中烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的消減動(dòng)態(tài)和最終殘留研究提供方法保證，對(duì)維護(hù)食品安全具有重要意義。對(duì)于一些復(fù)雜基質(zhì)，本研究所采取的凈化劑的凈化效果和適用性仍然可能有一些局限性，可能需要對(duì)前處理?xiàng)l件進(jìn)一步優(yōu)化以獲得更好的結(jié)果。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)鹽析材料NaCl和MgSO4的配比對(duì)回收率的影響較大，但其具體影響原理和最佳配比規(guī)律需進(jìn)一步探討。