不同顏色紅三葉種子活力的初步研究

呂鵬輝, 張震東, 王曄, 周吉紅, 宋振偉, 段留生, 李潤枝*

(1.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 北京 102206; 2.北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

紅三葉(TrifoliumpretenseL.)又叫紅車軸草、紅荷蘭翹搖，屬于豆科(Leguminosae)車軸草屬(TrifoliumL.)，多年生草本，是車軸草屬的最重要物種之一[1]。紅三葉植株具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，且生長迅速，有固氮改良土壤的作用，是最重要的栽培豆科牧草之一，普遍用作綠地植物、水土保持植物、藥用植物和優(yōu)質(zhì)牧草[2]。

種子活力是指在田間廣泛條件下，種子迅速整齊出苗和長成正常幼苗潛力的總稱[3]。高活力種子出苗率高、耐貯性強(qiáng)、幼苗健壯整齊、抗逆性強(qiáng)、生物產(chǎn)量高，而低活力種子易造成減產(chǎn)。在種子發(fā)育過程中，隨著種子的成熟，種皮呈現(xiàn)不同的顏色，即種子的顏色可以反映出種子成熟度的差異[4]。孫德利等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同成熟度的苦瓜種子與果實(shí)、假種皮顏色變化密切聯(lián)系，在生產(chǎn)上可將瓜皮顏色、假種皮顏色作為種子成熟度的估測(cè)指標(biāo)。同時(shí)，很多研究顯示，種子成熟度與種子活力密切相關(guān)。張曉潔等[6]測(cè)定了黑褐色、黃褐色、紅色、白色4種不同成熟度棉花種子的活力，結(jié)果顯示黑褐色和黃褐色種子的發(fā)芽率較高；常暉等[7]研究表明，黃芪種子種皮顏色越深、種子越大，種子活力就越高；李賀勤等[8]依據(jù)種子大小和顏色對(duì)甘藍(lán)種子進(jìn)行分級(jí)加工，結(jié)果表明種子大小和顏色分級(jí)能有效提高甘藍(lán)種子質(zhì)量，且存在種皮顏色越深種子活力就越高的變化趨勢(shì)。

目前，我國在紅三葉生產(chǎn)利用中還存在很多問題，如持久性較弱、再生性差、抗旱抗寒性差、成熟種子易脫落、不可機(jī)械收割等[9]。特別是紅三葉在生長過程中由于開花期較長，收獲時(shí)同一植株上種子成熟度不一致，種皮呈現(xiàn)黃色、黃綠色、黃褐色、黃紫色等不同顏色，同一種批中種子活力參差不齊，導(dǎo)致種子質(zhì)量不高，是生產(chǎn)中比較突出的問題[10]。張?jiān)芠11]對(duì)蒙農(nóng)1號(hào)紅三葉種子特征的研究表明，紅三葉種子顏色存在多種類型，其中黃色種子出現(xiàn)頻率最大，種子整體顏色在黃色和黃褐色之間。但是對(duì)于不同顏色紅三葉種子的活力研究，尚未見報(bào)道。因此，本研究以同一紅三葉種批中不同顏色種子為材料，通過常溫發(fā)芽試驗(yàn)、低溫發(fā)芽試驗(yàn)、干旱發(fā)芽試驗(yàn)及種子生理指標(biāo)測(cè)定，研究不同顏色種子的活力差異，明確種子成熟度與種子活力的關(guān)系，為紅三葉種子的清選加工和適期收獲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用紅三葉種子為試驗(yàn)材料，將同一批次種子按照顏色分為黃色種子(yellow seed,YS)、黃褐色種子(yellow-brown seed,HS)和褐色種子(brown seed,RS)，與三種顏色的混色種子(mix-color seed,MS)一同進(jìn)行試驗(yàn)(圖1)。所用種子來自淘寶北槿園藝官方店。

圖1 不同顏色的紅三葉種子

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗(yàn) 為了更加全面評(píng)價(jià)不同顏色紅三葉種子的種子活力情況，設(shè)置常溫發(fā)芽、低溫發(fā)芽和干旱發(fā)芽3個(gè)種子萌發(fā)試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果設(shè)置種子發(fā)芽試驗(yàn)的觀察時(shí)間為10 d。因而，常溫發(fā)芽試驗(yàn)的條件設(shè)置為20 ℃培養(yǎng)10 d；低溫發(fā)芽試驗(yàn)條件設(shè)置為4 ℃培養(yǎng)10 d，后轉(zhuǎn)入20 ℃培養(yǎng)10 d；干旱發(fā)芽試驗(yàn)為用10%PEG-6000溶液作為培養(yǎng)試劑，其他同常溫發(fā)芽試驗(yàn)。用1%次氯酸鈉溶液對(duì)紅三葉種子消毒10 min，用蒸餾水反復(fù)沖洗3遍。在發(fā)芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)中放置兩層濾紙，用去離子水潤濕，將消毒的紅三葉種子隨機(jī)選取100粒，擺放到發(fā)芽盒中，3次重復(fù)。放置到相應(yīng)萌發(fā)條件，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，發(fā)芽結(jié)束后測(cè)定各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)。發(fā)芽試驗(yàn)均在PRX-6WB光照培養(yǎng)箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)中進(jìn)行，24 h光照，光強(qiáng)8 000 lx。

發(fā)芽勢(shì)(germination energy，GE)、發(fā)芽率(germination percentage，GP)、發(fā)芽指數(shù)(germination index，GI)和平均發(fā)芽天數(shù)(mean germination time，MGT)按照以下公式進(jìn)行計(jì)算。

GE=規(guī)定天數(shù)發(fā)芽數(shù)/種子總粒數(shù)×100%

(1)

GP=末次計(jì)數(shù)發(fā)芽數(shù)/種子總粒數(shù)×100%

(2)

GI=∑(Gt/Dt)

(3)

MGT=∑(Gt×Dt)/∑Gt

(4)

式中，規(guī)定天數(shù)取4 d,Dt指第t天，Gt指Dt相對(duì)應(yīng)的發(fā)芽種子數(shù)。

1.2.2種子電導(dǎo)率測(cè)定 隨機(jī)選取100粒種子，用JA2003天平[邦西儀器科技(上海)有限公司]稱重后將種子放入裝有50 mL水的燒杯中，薄膜覆蓋后放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用DDS-307A電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定電導(dǎo)率[12]，3次重復(fù)。

電導(dǎo)率(μS·cm-1·g-1)=樣品值/樣品種子重量

(5)

1.2.3種子OD值測(cè)定 將種子放入燒杯，加入50 mL去離子水，放入25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以純水作為對(duì)照，分別浸種4、8、12、24 h時(shí)，用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(上海析譜儀器有限公司)測(cè)定286 nm吸收波長的光密度[13]，3次重復(fù)。

1.3 種子活力的綜合評(píng)價(jià)

用模糊數(shù)學(xué)隸屬法[14]對(duì)4種顏色紅三葉種子進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，在計(jì)算隸屬值時(shí)，先將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后計(jì)算每個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值[u(Xj)]、標(biāo)準(zhǔn)差系數(shù)(Vj)、權(quán)重系數(shù)(Wj)和綜合隸屬函數(shù)值(D)。

u(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(6)

u(Xj)=(Xmax-Xj)/(Xmax-Xmin)

(7)

(8)

(9)

(10)

若指標(biāo)與種子活力呈正相關(guān)，用公式(5)進(jìn)行計(jì)算，否則用公式(6)進(jìn)行計(jì)算。D值越大，種子活力越高；D值越小，種子活力越低。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2010對(duì)所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，然后再用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。選擇LSD差異法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同顏色紅三葉的種子萌發(fā)指標(biāo)

由表1可知，在常溫發(fā)芽試驗(yàn)中，紅三葉黃色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著高于其他3種顏色的種子(P<0.05)，分別為79%、89%和32.0，而黃褐色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色的種子(P<0.05)。黃色種子、黃褐色種子、褐色種子、混色種子的平均發(fā)芽天數(shù)分別為3.1、3.9、3.4和3.4 d，其中黃褐色種子的平均發(fā)芽天數(shù)顯著高于其他3種顏色的種子(P<0.05)。在低溫發(fā)芽試驗(yàn)中，黃色和褐色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無顯著差異，均較大，且顯著高于黃褐色種子的相應(yīng)指標(biāo)(P<0.05)。黃褐色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色的種子(P<0.05)。黃色種子的平均發(fā)芽天數(shù)顯著低于混色種子，與黃褐色和褐色種子差異不顯著。在干旱發(fā)芽試驗(yàn)中，黃色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)最高且顯著高于其他3種顏色種子，而黃褐色種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著低于其他3種顏色種子(P<0.05)。黃色種子的發(fā)芽天數(shù)最少，但是與褐色和混色種子差異不顯著，而黃褐色種子的發(fā)芽天數(shù)顯著高于其他3種顏色種子(P<0.05)。綜上可知，在常溫發(fā)芽、低溫發(fā)芽和干旱發(fā)芽試驗(yàn)中，黃色種子的發(fā)芽能力均顯著高于其他3種顏色種子，種子活力最高。

表1 不同顏色紅三葉的種子萌發(fā)指標(biāo)

2.2 不同顏色紅三葉種子萌發(fā)指標(biāo)的相關(guān)性分析

種子活力可以通過不同條件的萌發(fā)試驗(yàn)來進(jìn)行評(píng)價(jià)，而不同萌發(fā)指標(biāo)是否存在相關(guān)性是綜合評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。由表2可知，常溫發(fā)芽的發(fā)芽勢(shì)與干旱發(fā)芽的發(fā)芽勢(shì)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.999，與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.970和0.983；常溫發(fā)芽的發(fā)芽率與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.999；常溫發(fā)芽的發(fā)芽率與低溫發(fā)芽的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)以及干旱發(fā)芽勢(shì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；常溫發(fā)芽的發(fā)芽指數(shù)與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；常溫發(fā)芽的發(fā)芽天數(shù)與干旱發(fā)芽的發(fā)芽勢(shì)呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與干旱發(fā)芽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.997、-0.961、-0.975。由此可見，各萌發(fā)指標(biāo)間存在不同程度的相關(guān)性，因此通過綜合鑒定可以降低誤差，提高活力評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。

表2 不同顏色紅三葉種子萌發(fā)指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 不同顏色紅三葉種子浸出液的OD值和電導(dǎo)率

紫外分光光度計(jì)測(cè)定紅三葉種子浸泡4、8、12、24 h的OD值，結(jié)果見表3，可見，隨著浸泡時(shí)間的延長，種子浸出液的OD值不斷增加，在24 h時(shí)達(dá)到最大值。為了進(jìn)一步確定浸出液OD值和發(fā)芽率之間的關(guān)系，對(duì)種子浸出液OD值和常溫發(fā)芽率進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程，分別為y=-0.101 8x+0.339 3，R2=0.672 5(浸泡4 h)；y=-0.113 2x+0.443 3，R2=0.385 9(浸泡8 h)；y=-0.332 4x+0.726 0，R2=0.845 1(浸泡12 h)；y=-0.611 0x+1.095 9，R2=0.929 1(浸泡24 h)。由回歸方程得出，不同浸泡時(shí)間的浸出液OD值與紅三葉種子萌發(fā)率存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，即浸出液OD值越低，種子發(fā)芽率越高。其中浸泡24 h的浸出液的OD值與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)最高，R2=0.929 1，說明在本研究條件下，紅三葉種子浸泡24 h時(shí)浸出液的OD值能較好地反映紅三葉種子的活力。

表3 不同顏色紅三葉種子的電導(dǎo)率和OD值

不同顏色紅三葉種子浸泡24 h后，黃褐色種子的OD值最高，為0.80；黃色種子的最低，為0.53，且二者差異顯著。黃褐色種子的電導(dǎo)率也最高的，為428.2，且顯著高于其他顏色種子；黃色、褐色和混色種子的電導(dǎo)率差異不顯著。因此，本研究結(jié)果說明黃褐色種子的活力最低。

2.4 不同顏色紅三葉種子活力的綜合評(píng)價(jià)

隸屬函數(shù)分析結(jié)果(表4)顯示，黃色種子的D值最大，為0.913，黃褐色種子的D值最小，為0.002，表明黃色種子的活力最高，黃褐色種子的活力最低。4種不同顏色紅三葉種子的活力順序依次為：黃色種子>褐色種子>混色種子>黃褐色種子。

表4 不同顏色紅三葉種子檢測(cè)指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)分析

3 討論

種子劣變和生理紊亂引起的細(xì)胞膜完整性變化是造成種子活力差異的關(guān)鍵因素，種子活力越高，種子浸出液的OD值和電導(dǎo)率越低[15]。魯黎明等[13]研究表明, 在25 ℃條件下, 煙草種子經(jīng)過24 h浸泡后, 種子浸出液的紫外吸光值能夠在較大程度上反映煙草種子的活力，且與之呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Dias等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大豆種子浸泡8和12 h的電導(dǎo)率可以用于檢測(cè)大部分種子活力的差異，16、20和24 h浸泡液的電導(dǎo)率則可以用于檢測(cè)種子活力差異小的種子批。本研究發(fā)現(xiàn)，紅三葉種子浸泡24 h后的電導(dǎo)率能較好地反映種子活力。Mavi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，9個(gè)不同品種蘿卜種子的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率與電導(dǎo)率值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)果一致。

隨著種子成熟度逐步提高，種子的種皮顏色也越來越深，生長在母株不同部位的種子由于其接收的營養(yǎng)和成熟期的不同，收獲時(shí)同一種批中也存在不同顏色的種子，其活力之間也有差異。王廣印等[18]將同一蕹菜種批按照種子顏色分為三級(jí)，然后測(cè)定其種子活力，發(fā)現(xiàn)不同顏色種子的活力存在極顯著差異，種子顏色越深其活力越高。李錫香和胡淼[19]研究表明，深褐色紅菜苔種子的發(fā)芽勢(shì)、簡(jiǎn)化活力指數(shù)、發(fā)芽率均顯著高于深白色和灰褐色種子。董青松等[20]在廣金錢草種子顏色與發(fā)芽率相關(guān)性研究中表明，黃色種子的發(fā)芽率顯著高于其他顏色，同時(shí)在儲(chǔ)藏過程中，隨著種皮顏色的變淺，種子活力也隨之降低。由于紅三葉的開花期不一致，收獲時(shí)同一種批包含不同種子成熟度的顏色各異的種子。本研究通過常溫、低溫和干旱發(fā)芽試驗(yàn)比較同一紅三葉種子批中不同顏色種子的萌發(fā)指標(biāo)，結(jié)果表明，紅三葉黃色種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)明顯高于其他顏色，而發(fā)芽天數(shù)小于其他顏色種子，同時(shí)黃色種子浸出液的電導(dǎo)率和OD值也最低。黃褐色種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)明顯低于其他顏色，而發(fā)芽天數(shù)大于其他顏色種子。說明不同顏色紅三葉種子的活力存在差異，即種子成熟度與種子活力密切相關(guān)，這與上述其他植物的研究結(jié)果一致。通過模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)4種不同顏色的紅三葉種子活力，結(jié)果排序?yàn)辄S色種子>褐色種子>混色種子>黃褐色種子，本研究結(jié)果為紅三葉種子的清選加工和適期收獲提供了理論參考。