蒲公英不同溶劑提取物對(duì)果蔬采后幾種病原真菌的體外抑制作用

賀建華 賈小慧 宋?；?閻懷穎

摘要：以純化水和100%乙醇為提取溶劑，對(duì)采自永登武勝驛鎮(zhèn)的野生蒲公英全草進(jìn)行浸提，從浸膏得率、菌絲生長抑制率及孢子萌發(fā)抑制率三個(gè)方面，探討了不同溶劑提取物對(duì)果蔬采后幾種病原真菌的體外抑制效果。結(jié)果表明：醇提取法浸膏得率高于水提取法，高出31.2%;隨著蒲公英醇提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢、葡枝根霉菌絲抑制率均在不斷的提升，隨著蒲公英水提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢菌絲抑制率均在不斷的提升，但葡枝根霉菌絲抑制率先隨著水提取物濃度的增加而增加，當(dāng)水提物濃度增加到20mg/mL以上時(shí)，菌絲抑制率變化不明顯;80mg/mL的蒲公英水提取物對(duì)鐮刀菌、灰葡萄孢的菌絲生長及孢子萌發(fā)抑制率均在82%以上;80mg/mL的蒲公英醇提取物對(duì)擴(kuò)展青霉、鏈格孢、葡枝根霉的菌絲生長及孢子萌發(fā)抑制率均在63%以上。

關(guān)鍵詞：蒲公英;不同溶劑提取物;果蔬采后病原菌;體外抑菌

中圖分類號(hào)：S436.3;S436.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

0 引言

我國作為世界果蔬生產(chǎn)大國，因采后處理技術(shù)和管理措施未能及時(shí)跟進(jìn)，造成每年約有25%的產(chǎn)品因腐爛變質(zhì)而被白白浪費(fèi)，進(jìn)而造成了一定的環(huán)境壓力[]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)一步顯示，采后由病原真菌引起的果蔬損失率達(dá)到了30%[2]。造成果蔬采后腐爛的病原真菌主要有青霉屬（penieillum sp.）、鏈格孢屬（Alternaria sp.）、葡萄孢屬（Botlyris sp.）以及根霉屬（Rhizopus sp.）[3]。目前，化學(xué)方法可有效控制果蔬病害，但也伴隨著產(chǎn)生了病原菌抗藥性、藥物殘留以及環(huán)境污染等問題[4]。因此，綠色安全的天然果蔬防腐劑的開發(fā)利用必將成為一種新型的發(fā)展趨勢(shì)[5]。

蒲公英是一種常用于臨床的野生中藥材，隸屬于菊科。經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)全草含有甾醇、皂苷、多酚、類黃酮、多糖等多種活性成分[6]，具有抗菌消炎等功效。研究表明，蒲公英提取液對(duì)細(xì)菌[7]以及真菌[8]等均具有一定的抑制作用。蒲公英提取液對(duì)植物源病原真菌的抑制作用研究主要集中在板栗疫病菌、萵苣霜霉病、黃瓜霜霉病[8]，蘑菇根霉、番茄灰霉菌、蘑菇青霉菌[9]等病原物上。而對(duì)引起果蔬采后腐爛的幾種常見病原菌未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究探討了不同溶劑提取物對(duì)擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、鏈格孢（Alternaria alterna-ta）、鐮刀菌（Fusarium sulphureum）、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）的體外抑制作用，以期為蒲公英的不斷開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為果蔬采后病害的控制提供新的參考方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

帶根野生蒲公英于8月18日采摘自永登武勝驛鎮(zhèn);試驗(yàn)所用菌株擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、鏈格孢（Alternaria alternata）、鐮刀菌（Fusarium sulphure-um）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、葡枝根霉（Rhizopusstolonifer）均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院分離保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蒲公英預(yù)處理

參照馬井喜等[方法并作修改。將去除雜質(zhì)的蒲公英，在65℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，粉碎后過60目篩，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2蒲公英水提取物

參照王留等"的方法并作修改。取預(yù)處理好的蒲公英粉末150g，按照料水比1：25的比例加純化水浸泡12h，之后在80℃的水浴條件下浸提5h，提取4次，合并4次的浸提液，將浸提液用四層紗布進(jìn)行過濾，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將過濾液濃縮成浸膏，最后將浸膏置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3蒲公英醇提取物

參照劉海燕等[2并作修改。取預(yù)處理好的蒲公英粉末150g，按照料液比1：25的比例加100%的乙醇浸泡12h，之后在80℃的水浴條件下浸提5h，提取4次，合并4次的浸提液，將浸提液用四層紗布進(jìn)行過濾，之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將過濾液濃縮成浸膏，最后將浸膏置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4蒲公英提取物對(duì)菌絲生長抑制的影響

參照孟雅君[的方法并作修改。將擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢、葡枝根霉5種菌種在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)幾代，實(shí)驗(yàn)前7d再活化一次。用0.6cm的打孔器將供試菌株打成菌餅備用。將蒲公英浸膏分別用100%乙醇配置成初始濃度為0.075g/mL、0.15g/mL、0.3g/mL、0.6 g/mL、1.2g/mL的藥液，緊接著將藥液用細(xì)菌過濾器過濾，隨后各吸取1mL加入到14mL的PDA培養(yǎng)基中使其混勻倒成平板，此時(shí)，藥濃度即為5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL。同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照。將長有菌落的菌餅朝下放置在平板中央，每個(gè)培養(yǎng)皿接種一個(gè)菌餅，重復(fù)9次。在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。菌絲生長抑制率用下列公式計(jì)算。

1.2.5蒲公英提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用

參照戴岳等[14]的方法。將配置好的孢子懸浮液10pL分別均勻涂布到蒲公英提取物濃度為80mg/mL的PDA平板上（9cm），在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，隨后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算孢子萌發(fā)率和孢子抑制率。

2結(jié)果與分析

2.1蒲公英不同提取物得率比較

從浸膏得率可以看出，100%乙醇的提取得率高于水提取得率，兩種提取物的得率分別為12.45%和9.49%，醇提取法得率比水提取法高出31.2%。試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)醇提法過濾速度較水提法快，整體用時(shí)較短，同時(shí)提取率也高于水提法，因此，可選擇100%乙醇對(duì)蒲公英進(jìn)行提取。王超群等研究發(fā)現(xiàn)醇提法用時(shí)較短，但提取物的得率低于水提取法，造成差別的原因可能與所用的提取工藝不同有關(guān)，見表1所列。

2.2不同濃度的蒲公英提取物對(duì)供試菌種菌絲生長活性的影響

由表2可以看出，不論是醇提取物還是水提取物，均對(duì)供試菌絲的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。同時(shí)，隨著蒲公英醇提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢、葡枝根霉菌絲抑制率均在不斷的提升，隨著蒲公英水提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢菌絲抑制率均在不斷的提升，但葡枝根霉菌絲抑制率先隨著水提取物濃度的增加而增加，當(dāng)水提物濃度增加到20mg/mL以上時(shí)，菌絲抑制率變化不明顯。

對(duì)擴(kuò)展青霉而言，醇提取物的菌絲抑制率高于水提取物，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物的菌絲抑制率為45.51%，而醇提取物的菌絲抑制率達(dá)到了為82.10%;對(duì)鏈格孢而言，醇提取物的菌絲抑制率高于水提取物，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物的菌絲抑制率為54.49%，而醇提取物的菌絲抑制率為63.11%;對(duì)鐮刀菌而言，水提取物的菌絲抑制率高于醇提取物，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物的菌絲抑制率為88.36%，而醇提取物的菌絲抑制率僅為46.87%;對(duì)灰葡萄孢而言，水提取物的菌絲抑制率高于醇提取物，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物的菌絲抑制率為89.92%，而醇提取物的菌絲抑制率僅為66.02%;對(duì)葡枝根霉而言，醇提取物的菌絲抑制率高于水提取物，當(dāng)提取物濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物的菌絲抑制率為30.37%，而醇提取物的菌絲抑制率達(dá)到了87.24%。

綜上所述，較醇提物相比，蒲公英水提取物對(duì)鐮刀菌、灰葡萄孢的菌絲生長可發(fā)揮較好的抑制作用，且在濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物對(duì)灰葡萄孢的抑制作用（89.92%）>鐮刀菌的抑制作用（88.36%）。與水提物相比，蒲公英醇提取物對(duì)擴(kuò)展青霉、鏈格孢、葡枝根霉可發(fā)揮較好的抑制作用，且在濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，醇提取物對(duì)葡枝根霉的抑制作用（87.24%）>擴(kuò)展青霉的抑制作用（82.10%）>鏈格孢的抑制作用（63.11%）。這也表明蒲公英不同溶劑提取物可對(duì)不同的菌種表現(xiàn)出不同的抑制作用。王超群等[15]在研究蒲公英醇提法、水提法及超聲波法3種方法對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制作用時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)乙醇提取所得的蒲公英活性成分更有利于對(duì)擴(kuò)展青霉發(fā)揮抑制作用;也有研究發(fā)現(xiàn)蒲公英水提物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，而蒲公英醇提物對(duì)炭疽桿菌等菌種有很好的抑制作用161。因此，在以后的研究中，還需要針對(duì)不同菌種選用適合的提取方法，以期使活性成分能最大限度地發(fā)揮作用。

2.3蒲公英提取物對(duì)供試菌種孢子萌發(fā)的抑制作用

由表3可以看出，80mg/mL的蒲公英水提取物和醇提取物均可對(duì)供試菌種的孢子萌發(fā)產(chǎn)生一定的抑制作用。較醇提物而言，80mg/mL的蒲公英水提取物對(duì)鐮刀菌和灰葡萄孢的孢子萌發(fā)可產(chǎn)生較好的抑制作用，抑制率分別為82.32%和88.67%;和水提物相比，80mg/mL的蒲公英醇提取物對(duì)擴(kuò)展青霉、鏈格孢、葡枝根霉的孢子萌發(fā)抑制較好，其對(duì)葡枝根霉的孢子萌發(fā)抑制率（89.24%）>擴(kuò)展青霉（75.65%）>鏈格孢（72.61%）。

3結(jié)論

（1）從浸膏得率可以看出，醇提取法浸膏得率高于水提取法，浸膏得率達(dá)到了12.45%，比水提取法高出31.2%。

（2）隨著蒲公英醇提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢、葡枝根霉菌絲抑制率均在不斷的提升，隨著蒲公英水提取物濃度的增加，擴(kuò)展青霉、鏈格孢、鐮刀菌、灰葡萄孢菌絲抑制率均在不斷的提升，但葡枝根霉菌絲抑制率先隨著水提取物濃度的增加而增加，當(dāng)水提物濃度增加到20mg/mL以上時(shí)，菌絲抑制率變化不明顯。

（3）蒲公英不同溶劑提取物可對(duì)不同菌種的菌絲生長表現(xiàn)出不同的抑制作用。蒲公英水提取物對(duì)鐮刀菌、灰葡萄孢的菌絲生長可發(fā)揮較好的抑制作用，且在濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，水提取物對(duì)灰葡萄孢的抑制作用（89.92%）>鐮刀菌的抑制作用（88.36%）。與水提物相比，蒲公英醇提取物對(duì)擴(kuò)展青霉、鏈格孢、葡枝根霉可發(fā)揮較好的抑制作用，且在濃度達(dá)到80mg/mL時(shí)，醇提取物對(duì)葡枝根霉的抑制作用（87.24%）>擴(kuò)展青霉的抑制作用（82.10%）>;鏈格孢的抑制作用（63.11%）。

（4）80mg/mL的蒲公英水提取物和醇提取物均可對(duì)供試菌種的孢子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。蒲公英水提取物對(duì)鐮刀菌和灰葡萄孢的孢子萌發(fā)可產(chǎn)生較好的抑制作用，抑制率分別為：82.32%和88.67%;蒲公英醇提取物對(duì)擴(kuò)展青霉、鏈格孢、葡枝根霉的孢子萌發(fā)可產(chǎn)生較好的抑制作用，其抑制順序?yàn)椋浩现Ω沟逆咦用劝l(fā)抑制率（89.24%）>擴(kuò)展青霉（75.65%）>鏈格孢（72.61%）。

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